一、微生物的分离、纯化
实验目的
（1）了解微生物分离与纯化的原理。
（2）掌握常用的分离与纯化微生物的方法。
实验原理
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单个菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从牛场周围的土壤中分离不同类型的微生物。
实验材料
（一）培养基
高氏I号琼脂培养基（培养基1）、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养基4）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基，培养基27）。
（二）溶液或试剂
10%酚液、链霉素和土样、4%水琼脂。
（三）仪器及其他用品
无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、显微镜、血细胞计数板、涂布器等。
实验流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑取单菌落→保存
实验步骤
（一）稀释涂布平板法
1.倒平板
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基分别加热熔化，待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚液数滴，PDA培养基中加入链霉素溶液（终浓度为30μg/mL），混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三块平皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
2.制备土壤稀释液
称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL，加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液（操作过程，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管）。
3.涂布
将上述每种培养基的3个平板底面（小盖）分别用记号笔写上10-4、10-5和10-63种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2mL，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10min，使菌液浸入培养基。
4.培养
将高氏I号培养基平板和PDA培养基平板倒置于28℃温箱中培养3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。
5.挑取菌落
将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述3种培养基斜面上，分别置于28℃和37℃温箱培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
（二）平板划线分离法
1.倒平板
按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。
2.划线
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的方法是用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线若干条，采用“之”字形方式划线，线条之间不要交叠，第一次划线区域占平皿的1/2，再转动平皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，用记号笔在皿底做好标记，然后倒置于温箱培养（除特殊要求外，固体平板培养物应倒置培养，以防止平皿上产生冷凝水影响菌落观察，同时也避免了底盖分离发生污染）。
3.挑菌落
同稀释涂布平板法，一直到认为分离的微生物纯化为止。
4.结果判定
所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。
在3种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。
二、微生物的接种技术
实验目的
（1）学习掌握微生物的几种接种技术。
（2）建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
实验原理
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求和方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
实验材料
（一）菌种和培养基
菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
培养基：普通琼脂斜面和平板、营养肉汤、普通琼脂高层（直立柱）。
（二）仪器及其他用品
酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角形接种棒等接种工具。
实验流程
斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法
实验步骤
（一）斜面接种法
斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。
通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落或挑取斜面、培养基、肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。
将菌种斜面培养基（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管）持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈0～45°角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。用右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。
右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拔出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。
将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用记号笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。
（二）液体接种法
液体接种法多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法、注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下。
由斜面培养物接种至液体培养基时，用接种环从斜面上蘸取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。
由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针蘸取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。
接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。
（三）固体接种法
1.平板接种
见平板划线分离法。
2.斜面接种
见斜面接种法。
3.三点接种（点植法）
在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。
4.固体曲料接种
普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已介绍了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为以下两种：
（1）用菌液接种固体料，包括用刮洗菌苔制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。
（2）用固体种子接种固体料，包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀，一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
（四）穿刺接种法
此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法、注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。
实验结果
分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的微生物生长情况和培养特征。
思考题
（1）如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。
（2）为什么高氏I号培养基和PDA培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？
（3）试述如何在接种中贯彻无菌操作的原则？
（4）以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。
（5）试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。
