实验目的
（1）了解并掌握培养基的配制、分装方法。
（2）掌握各种实验室灭菌方法及技术。
实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下熔化，于45℃以下凝固。但多次反复熔化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养菌使用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
实验材料
（一）器皿及其他用品
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盘、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、棉绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
（二）药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂（粉或条）、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽汁、磷酸铵、0.1mol/L NaOH溶液、0.1mol/L HCl溶液。
实验流程
称量→溶解→定容→调pH→加琼脂→过滤（可省略）→分装→包扎→灭菌（高压蒸汽灭菌）→摆斜面、倒平板
实验步骤
（一）培养基的制备
1.称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2.溶解
用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他原料，待完全熔化后，补足水分。
3.调节pH
根据培养基对pH的要求，用0.1mol/L NaOH溶液或0.1mol/L HCl溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。
4.融化琼脂
固体或半固体培养基需加入一定量琼脂（固体1.5%～2.0%；半固体0.3%～0.5%）。琼脂条加入后，置电炉上一边搅拌一边加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5.过滤分装
先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或在两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的50%为宜。
6.包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。标签用记号笔或铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。
7.灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃、20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成分。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
8.倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃，立刻倒平板。
（二）灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
1.湿热灭菌法
（1）煮沸消毒法 注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸15～30min，对于芽孢则需煮沸1～2h。
（2）高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到0.100MPa（1.05kg/cm2）时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
（3）操作方法和注意事项
①加水：打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水或蒸馏水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。
②装料、加盖：灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，不漏气。
③排气：打开排气口（也称放气阀）。插上电源加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。
④升压、保压和降压；当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
⑤灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养。经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
2.干热灭菌法
使用干热空气杀灭微生物的方法称为干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品、液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
（1）灭菌前的准备 玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。
常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：
①平皿：以旧报纸或牛皮纸紧密包紧，一般以6～12套做一包；或装在金属平皿筒内待灭菌。
②三角瓶：在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染。
③吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花，以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈60°角，并将右端多余的报纸打一小结，或装入金属管筒内进行灭菌。
④三角涂布棒：与包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45°角，并将右端多余的报纸打一小结。
（2）干燥箱灭菌 将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30min即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。用此法灭菌时，绝不能用油纸、蜡纸包扎物品。
（3）火焰灭菌 直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环、接种针或其他金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。
实验结果
（1）记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
（2）试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。
思考题
（1）制备培养基的一般程序是什么？培养基应具备哪些条件？
（2）在培养基配制操作过程中应注意什么问题？为什么？
（3）灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
（4）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
（5）高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压？试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。
（6）高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后什么情况下才可以开锅盖取出灭菌物品？
（7）玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥？
（8）对含糖（如含葡萄糖或乳糖等）培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力，多长时间灭菌为宜？
（9）蒸汽加热灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？
（10）干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？
（11）试比较几种物理灭菌方法的适用范围、灭菌条件和注意事项。
