一、细菌的简单染色法
实验目的
（1）学习微生物涂片、染色的基本技术。
（2）掌握细菌的简单染色法。
（3）初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。
实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用做简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
实验材料
（一）菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌（Micrococcus luteus）约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。
（二）染色剂
吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），石炭酸复红染液（见附录II）。
（三）仪器及其他用品
显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水等。
实验流程
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
实验步骤
（一）涂片
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
（二）干燥
室温自然干燥。也可以将涂面朝
上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
（三）固定
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。
（四）染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1或2滴于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。
（五）水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要用水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
（六）干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可（注意勿擦去菌体）。
（七）镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
实验结果
绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。
二、革兰氏染色法
实验目的
（1）了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
（2）学习掌握革兰氏染色技术，巩固光学显微镜油镜的使用方法。
实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如复红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成“结晶―”的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水，使就聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使“结晶―”的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使“结晶―”的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
（二）染色剂
结晶紫染色液、鲁格尔氏碘液、95%乙醇、番红复染液（见附录II）。
（三）仪器及其他用品
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。
实验流程
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检
实验步骤
（一）涂片
1.常规涂片法
取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2.“三区”涂片法
在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环挑取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合在含有两种菌的混合区，干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色，涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
（二）初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于2个玻片的涂面上，染色1min，倾去染色液，用细水流冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
（三）媒染
用鲁格尔氏碘液媒染约1min，水洗。
（四）脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，革兰氏阴性菌被误染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌被误染成革兰氏阴性菌。脱色时间一般为30s。
（五）复染
在涂片上滴加番红液复染1min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
革兰氏染色操作步骤。
（六）镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
（七）实验结束后处理
清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸蘸取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸清洗，晾干后备用。
实验结果
（1）根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
（2）列表简述两株细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。
思考题
（1）哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
（2）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
（3）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
（4）不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
（5）你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？
（6）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
（7）如果涂片未经热固定，将会出现什么问题？加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
三、细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色法
实验目的
（1）学习并掌握芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色的基本方法及原理。
（2）了解细菌的芽孢和鞭毛在细菌形态学鉴定上的重要性。
实验原理
细菌的芽孢壁比营养细胞的细胞壁厚而致密，透性低，着色与脱色均比营养细胞困难。因此，先采用一种碱性染料在微火上加热，使菌体和芽孢均染上颜色，再用水冲洗，则菌体已脱色，而芽孢所着颜色难以洗脱。当用另一种对比鲜明的染料使菌体着色时，即可明显区分芽孢体的结构。
荚膜是包在细菌细胞壁外面的一层黏液性物质，与染料亲和力低，不易着色。故一般采用衬托染色法（又称负染色法），使菌体和背景着色，而将不着色透明的荚膜衬托出来，以便于观察。荚膜薄而易变形，制片时不宜火焰固定，而采用甲醇进行化学固定。
细菌的鞭毛非常纤细，其直径为10～20nm，于普通光学显微镜下难以观察到。因此在染色时，采用不稳定的胶体溶液作为媒染剂沉积于鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，然后再着色，方可在普通光学显微镜下观察。
实验材料
（一）待染细菌培养物
（1）芽孢染色用菌为枯草芽孢杆菌20h的培养物；
（2）荚膜染色用菌为圆褐固氮菌斜面培养物；
（3）鞭毛染色用菌为连续传代2～3次的枯草杆菌或普通变形杆菌12～18h的斜面培养物。鞭毛染色宜用新鲜的菌体，菌龄长的细菌鞭毛易脱落。
（二）染色剂
孔雀绿染液、0.5%沙黄染液、石炭酸复红染液、碱性美蓝染液（又称多色彩性美蓝或骆氏美蓝）、瑞特氏染色液、姬姆莎染色液、草酸铵结晶紫染色液、鞭毛染色液（见附录II）。
（三）仪器及其他用品
同简单染色法。
实验流程
涂片→干燥→固定→染色（芽孢、荚膜或鞭毛）→镜检→玻片清洗
实验步骤
（一）芽孢染色法
1.孔雀绿、沙黄染色法
在干燥、固定好的涂片上滴加3～5滴5%孔雀绿染液，持玻片于酒精灯上微火加热，使之冒蒸汽，开始计时2～5min，并随时补加染液，切勿沸腾或蒸干，防止加热过度、涂片炸裂。冷却后，用水冲洗，再用0.5%沙黄染色液复染1min。水洗，滤纸吸干后镜检。芽孢呈绿色、菌体或营养体呈红色（所用玻片最好先以酸液处理，可防绿色褪失）。
2.复红美蓝染色法
在干燥、固定好的涂片上滴加石炭酸复红液，微火加热至冒蒸汽，经2～5min后水洗；以5%醋酸脱色至淡红色为止，水洗；以碱性美蓝复染1min后水洗，吸干水分，镜检。芽孢呈红色，菌体呈蓝色。
（二）荚膜染色法
1.美蓝染色法
涂片自然干燥，甲醇固定1min后，以久储的碱性美蓝做简单染色，镜检；荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。
2.瑞特氏染色法
在自然干燥，甲醇固定的涂片上，按涂抹面大小盖一小块清洁滤纸片，在其上滴加瑞特氏染色液至略湿，并酌情补加，维持不干，经3～5min后以水冲洗，滤纸吸干，镜检。荚膜呈淡紫色，菌体呈蓝色。此法的染色液经滤纸滤过后，可避免沉渣黏附涂片上而影响观察效果。
3.姬姆莎氏染色法
在干燥、甲醇固定后的涂片上滴加足量的稀释姬姆莎染色液（于5mL煮沸中性蒸馏水中滴加5～10滴姬姆莎染色原液）。染色30min或数小时至24h，水洗，滤纸吸干，镜检。荚膜呈淡紫色，菌体呈蓝色。
4.节思明（Jasmin）氏荚膜染色法
取9mL含有0.1%石炭酸的生理盐水，加入1mL无菌血清（各种动物的血清均可）混合后成为涂片稀释液。取此液一接种环置于载玻片上，又以接种环取少许细菌均匀混合其中，涂成薄层，任其自然干燥，置甲醇中处理，立即取出，火焰上烧去甲醇。以革兰氏染色液中的草酸铵结晶紫染色30s，干后镜检。背景淡紫色，菌体深紫色，荚膜无色。
（三）鞭毛染色法
为了使菌液流过载玻片时能迅速展开，保持细菌的自然形态，应选用绝对无油、光滑无划痕的载玻片。在载玻片的一端滴适量生理盐水，用接种环挑取少许斜面底部有水的菌体（注意勿挑出培养基），将接种环悬放于水滴中片刻，再将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴流至另一端，然后放平在空气中自然干燥。将鞭毛染色液滴在载玻片的有菌处，经2～3min后水洗（特别注意勿使水流直接冲洗有菌处），自然风干后镜检。菌体与鞭毛均为紫色。
（四）玻片的清洗方法
将载片置于洗衣粉液（洗衣粉事先用水溶化，滤纸除渣后再使用）中煮沸10min。稍冷却，将之用镊子逐片夹出，自来水冲洗。再放入浓洗液中浸沉24h。先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗净。置95%乙醇中脱水、脱油备用。经洗净处理好的载玻片滴上水后，能均匀散开。
实验结果
（1）绘图说明枯草芽孢杆菌的形态、芽孢的形状及其着生位置。
（2）绘图说明圆褐固氮菌的菌体及其荚膜的形状。
（3）绘图说明普通变形杆菌的菌体形态及其鞭毛着生位置。
