实验目的
（1）学习并掌握油镜的工作原理和使用方法。
（2）复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
实验原理
微生物的最显著特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。本实验将介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和样品制作。
普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像。它由机械装置和光学系统两大部分组成。显微镜的光学系统包括：物镜、目镜、反射镜和聚光器四个部件，其中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
一般微生物学使用的显微镜有三个物镜，即低倍镜（4～10倍）、高倍镜（40～45倍）和油镜（90～100倍），油镜对微生物学研究非常重要。油镜使用时需在载玻片与镜头之间滴加香柏油，一方面是增加照明亮度，油镜的放大倍数大、焦距短、直径小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入物镜），有些光线因折射或反射不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。为了减少通过光线的损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n=1.52），其原理。另一方面是增加显微镜的分辨率。显微镜的分辨率或分辨力（resolution of resolving power）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。显微镜的优劣主要取决于分辨率（D）的大小：
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角（光线投射到物镜上的最大角度）和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：
NA=nsinα
式中α――镜口角的半数，它取决于物镜的直径和焦距。一般来说，在实际应用中最大只能达到120
n――介质折射率
由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.00和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等物镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65μm左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。大部分细菌的直径在0.5μm以上，所以油镜更能看清细菌的个体形态。
实验材料
（一）菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）染色玻片标本。
链霉菌（Streptomyces sp。）及青霉菌（Penicillium sp。）的水封片。
（二）溶液或试剂
香柏油、二甲苯。
（三）仪器及其他用品
显微镜、擦镜纸等。
实验流程
安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检（低倍镜→高倍镜→油镜）→擦镜→复原
实验步骤
（一）观察前的准备
1.显微镜的安置
置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约10cm。镜检时姿势要端正。
2.光源调节
安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。若使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
3.双筒显微镜的目镜调节
根据使用者的个人情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
4.采光器数值孔径值的调节
正确使用聚光镜才能提高镜检的效果。聚光镜的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。
（二）显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对宽，易发现目标及确定检查的位置。
1.低倍镜观察
将细菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10倍物镜，使其接近标本，用粗准焦螺旋慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细准焦螺旋调节使物像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
2.高倍镜观察
在低倍镜下找到合适的观察目标，并将其移至视野中心后，将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后，微调细准焦螺旋使物像清晰，利用推进器移动标本找到需要观察的部位，并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察。
3.油镜观察
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗准焦螺旋将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗准焦螺旋将镜筒小心地降下，使油镜镜头浸在油中，并几乎与标本接触时止（注意：切不可将油镜镜头压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头）。将聚光器升至最高位置并开足光圈（若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也滴加香柏油，保证其达到最大的效能），调节照明使视野的亮度合适，用粗准焦螺旋将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细准焦螺旋使其清晰准焦为止。然后用相同的方法观察其他样本。
（三）显微镜用后的处理
上升镜筒，取下载玻片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，而后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用绸布清洁显微镜的金属部件。将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下以免物镜与聚光镜发生碰撞。套上镜套，放回原处。
实验结果
分别绘出在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌、链霉菌及青霉菌的形态，包括在3种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。
思考题
（1）用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？
（2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
（3）什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
（4）影响显微镜分辨率的因素有哪些？
（5）根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效地观察。
