实验目的
了解并掌握对乳与乳制品生产过程和产品进行微生物检测时所采用的取样方法。
实验原理
微生物检验时，抽取大量有代表性的样品是必要的。对于有包装的产品，只能在化验室打开包装，而且取样必须进行无菌操作。所有用于取样的器具必须预先包扎灭菌。盒装、罐装、包装或装在其他容器中的批量产品应随即抽取一定数量的样品逐个检测。国际食品微生物标准委员会（International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF，1986）对食品的混合、加工类型、储存方法及微生物检测项目的抽样方法进行了详细的规定。在讨论无菌取样的原因和采集方法之前，必须要理解“无菌的”这一术语，“无菌”一般用于取样中，意味着取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。无菌样品的采集基本是为了支持、针对工厂的卫生条件状况的检查结果。
实验内容
（一）检验前的准备工作
1.包装无菌取样的工具
拥有正确的采取产品或加工过程的无菌取样器械工具是至关重要的。除非使用合适的采集工具，否则样品的完整性会被怀疑，甚至使样品毫无意义。为了避免没有合适的取样工具，建议建立一个无菌取样的分析清单来收集取样工具。如果可能，盛样品的容器在最初进入加工区之前应当被预先标识，如样品号、取样日期、取样人等。这样可以使在不同的工厂条件下的样品取样更为方便一些。附加样品号码一般在样品采集中被正式确定下来，因此不用预先标明。
人员的工具设施，如工作服、发网或消毒处理过的清洁的鞋靴必须具备有助于证明采集者没有污染到食物产品或样品。
2.生产线样品
生产线样品一般是指原材料、原料生产用水、包装材料或其他任何在生产线使用的材料。生产线样品的采集一般用来确定细菌污染源是否来自于原材料或加工工序中的某些地方。
3.环境样品
环境样品需用棉拭子进行涂抹（注：棉拭子样品不能给出/测出微生物的定时结果，因为样品量非常少，显著微生物经常会丢失）。棉拭子的取样部位一般为食品接触面和地面喷溅物。在环境样品来源和食物产品的污染方面，考察墙壁、顶部管道和检验中的其他潜在污染源程序，并记录其可能的联系，可以使样品更具实际意义。
4.器具准备
（1）干冰 如果使样品在储运过程中保持冷却，一些种类的制冷剂是必需的。检查干冰袋子与样品是否有接触，如果泄漏可能污染样品，也可以用湿冰，湿冰可以由工厂提供，然而取样前必须清楚这一点，如果想保持样品冷冻，干冰应在检验前备妥。
（2）盒子或制冷皿 储藏、运输样品时，如果样品不需冷冻，那么用一个盒子即可，但如果样品需要冷却，一个标准的制冷皿或保温箱是必须使用的，一般来讲制冷皿随带着一个塑料袋，样品可以放进袋子里，制冷剂（干冰等）可以放置在袋外，这样可以避免样品被冰污染。
（3）灭菌容器 从塑料袋到灭菌的加仑漆桶，可以用于有锐利边角的产品。
（4）取样工具 包括茶匙、角匙、尖嘴钳、量筒和烧杯，工具的类型一般由取样产品来决定。所有取样设施和容器的灭菌日期应当被检查，灭菌时间应当在仪器设施的标签和包装上标明，一些仪器设施可以在当地实验室灭菌处理或购买灭菌仪器，在当地实验室灭菌的仪器设施一般可以保持至少2个月，过期后设施必须重新灭菌。
（5）灭菌手套 灭菌手套在采样中并非必须使用，如果一个产品在样品收集过程中必须被接触，那么最好让工厂生产线的工人来做（加工处理产品的工人），将样品放入收集容器中，既然工人在生产过程中处理接触产品，那么我们就不能认为他们对产品又有附加的污染。当用手套时必须用一种避免污染的方式戴上，手套的大小必须适合工作的需要。
（6）无菌棉拭子 一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域，使用棉拭子一般有一个正确的程序，打开棉拭子剥掉表皮，然后必须小心地放在试管头上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取样的部位，如案板头或顶部管道，然后从试管头上小心翼翼地将拭子放入――将其全部推入直到试管中部。
（7）灭菌全包装袋 袋子必须购买灭菌的，使用时只需撕掉封头，张开袋子，将样品放入，然后将袋子顶端卷起，用线绳扎牢；底部应当折叠两次，以便线绳不会穿透塑料袋，导致样品泄漏。当样品收集时，样品采集时的条件例如产品的温度、地点等，连同样品号，一并记录入检验员的注释说明中，取样的样品可以从样品号、采集日期、附加样品号、最初调查人和其他鉴别信息来区分。当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。
（二）取样方法
1.液体样品
对于液体样品（如牛乳、奶昔、糖浆）一般盛放在储罐中，可以连续或定期将其混匀，也可以在取样前将液体上下颠倒（或用一个灭菌的长柄勺搅拌）使其完全混匀。大量样品（100～500mL）要放在已灭菌的容器中送往实验室。在实验室取样检测之前应将液体样品再彻底混匀一次。
2.固体样品
依所取样品的材料不同，所使用的工具也不同。固态样品常用的取样工具有灭菌的解剖刀、勺子或软木钻子等。乳粉等易于混匀的食品，其成品质量均匀、稳定，可以抽取少量样品（如100g）检测。但散装样品就必须从多个点取大样，且每个样品都要单独处理，在检测前要彻底混匀，并从中取一份样品进行检测。
3.表面取样
通过惰性载体可以将表面样品上的微生物转移到合适的培养基中进行微生物检测，这种惰性载体既不能引起微生物死亡，也不能使其增殖。这样的载体包括清水、拭子、胶带等。取样后，要使微生物长期保存在载体上，做到既不死亡又不增殖会十分困难，所以应尽快地将微生物转接到适宜的培养基中。转移前耽误的时间越长，品质评价的可靠性就越差。
一个改进的方法是通过影印法直接将微生物由样品表面转接到培养基表面。有两种较成功的影印技术：一种是琼脂肠；一种是影印盘。影印技术和胶带转接法不能做系列稀释，因此，只有在菌体量较少时才适用。使用影印技术、胶带、触片和拭子等取样的最大优点是检测时不破坏样品。
以下7种取样的取样量是不等的，也并不完全地按照表面样品细菌数多少的顺序进行取样级别的划分。
（1）表面切片法 用灭菌解剖刀或镊子切取一薄层样品。将样品放入装有适当稀释度的适宜稀释液的容器中，均质后得到初始浓度10-1的样品稀释液。
（2）淋洗法 用10倍于样品的灭菌稀释液（质量比）对样品进行取样，然后配成10-1的样品稀释液，这种取样方法可用于挤奶器等器具。由于直接用食品在稀释液中搅拌的方法不能获得食品中细菌的实际数量，所以建议把样品充分粉碎后再进行淋洗。淋洗液的搅拌幅度及随后的液体移取应该准确。报告结果时，应注明该结果仅代表样品表面的细菌数。
（3）棉拭子
①棉―毛拭子：用干燥的棉―毛缠在4cm长，直径1～1.5cm的木棒或不锈钢丝上做成棉―毛拭子。然后将拭子放在合金试管中，盖上盖子后灭菌。将拭子在25%的Ringer氏溶液中浸湿，然后在待测样品的表面缓慢旋转拭子平行用力涂抹，用相同的角度再涂抹一次。在整个涂抹的过程中，必须小心地保证拭子在测试区域内。把拭子重新放回试管，加入25%Ringer氏溶液10mL，上下振荡试管10次以便把拭子上的细菌漂洗下来，按要求准备计数平板和稀释液。记录每1mL拭子漂洗液中的细菌数，计算待测表面每1cm2的细菌数。
②藻酸盐棉拭子：它由海藻酸钙羊毛制成。每个拭子所用的藻酸盐一般不超过50mg。将海藻酸盐羊毛缠在直径为1.5mm的木棒上做成1～1.5cm长，直径7mm的拭子，在25%Ringer氏溶液中浸湿后，放在10cm×1cm金属试管中121℃高压灭菌15min。用软木塞代替棉塞，方便实用，还可以把木棍嵌在木塞中，制成一个木柄。将拭子紧压在待测样品表面缓慢转动平行涂抹。由于藻酸盐羊毛非常光滑，为防止拭子松开，在涂抹时直接旋转，然后用相同的角度再涂抹一次。涂抹完毕，进行实验室检测。用无菌操作方法剪断拭子，头部放入螺纹瓶中，瓶中装有10mL含1%六偏磷酸钠的25%Ringer氏溶液。盖上瓶塞，用力振动瓶子。这样可使拭子上细菌溶于水中，配成细菌悬液。用适当培养基对1mL和0.1mL样品悬液进行平板计数。因为六偏磷酸钠对细菌有轻度的危害。为了降低六偏磷酸钠的终浓度，减少其抑制的作用，每个平皿应加入15～20mL培养基。报告每1cm2涂抹表面的细菌数。
（4）胶带 这种取样方法需要用不干胶胶带（如Sello胶带、Scotch胶带等）或不干胶标签。不干胶标签的优点是能把采样的详细情况写在标签的背面，贴在一个非黏性粘贴架上。不干胶胶带取样后同样需要转接到一个合适的无菌粘贴架上。同时，这种方法也可用于检测食品表面和仪器设备表面的微生物。胶带和标签制成后，可用易挥发溶液进行短时间的自净灭菌。必须确保灭菌后的胶带无菌或残留的微生物失去活力。胶带或标签的一端要向内弯回大约lcm左右以方便拿取。胶条从粘贴架上取下压在待测物质表面，迅速取样后，重新粘回模板上。送到实验室后，将胶带从粘贴架上取下，压在适当的培养基表面，然后弃置。
（5）琼脂肠 琼脂肠由放在无菌圆塑料袋（或筒）中的无菌琼脂培养基制成。可在实验室制作，国外也有成品出售。使用时，在琼脂的末端无菌切开，将暴露的琼脂面压在样品表面，用无菌解剖刀切下一薄片，放在培养皿上培养。
（6）影印盘 影印盘是一种无菌的塑料盘。可以从许多厂家很方便地买到。按要求在容器中央填满足够的琼脂培养基，并形成凸状面，需要时将琼脂表面压在待测物表面。
（7）触片 用一个无菌玻片触压食品表面，带回实验室。固定染色（如革兰氏法）后在显微镜下检测；另一种方式，将取样的玻片压在倒有培养基的平板上，将细菌转接到琼脂表面（用无菌镊子），移去玻片后，培养平板。尽管这种方法不能用于菌体计数，但能快速判断优势菌落的类型，特别是对诸如生肉、禽肉和软乳酪等食品更为适用。
4.厌氧微生物的取样
取样检测厌氧微生物时，很重要的一点是食品样品中不能含有游离氧，例如在肉的深层取少量样品后，要避免使之暴露在空气当中。如只能抽取小样品，或需使用棉拭子取样时，就要用一种合适的转接培养基来降低氧的浓度。例如，在使用藻酸盐棉拭子取样后，就不能再放入原来的试管中，而应放在盛有转接培养基的瓶中。使用上述棉拭子时，可先用强化的梭菌培养基浸湿。
（三）取样计划
微生物检验的特点是以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。
1.低含量微生物的取样
如果食品中微生物含量低于菌落计数的灵敏度，就可能要用到多管技术对其进行活菌计数，采用连续稀释法。需要时，可将大量的（如l00g、10g和1g）食品接种到含有适当培养基的大容器中。
另一种取样方法被称作质征取样计划，即抽取一系列数量相同的样品，检测是否含有可疑细菌。如果未检出可疑微生物，通过该方法能够估算出检测到至少包含一个可疑菌的单元所需抽取的最大样品量。
如果是小包装食品（如罐装食品）则更适于采用这种取样方法。这种质征取样计划已用于检测罐装食品和袋装牛乳等食品，这些食品中含有被杀死了的细菌。另外，它也适用于分装成大样的食品（如大桶装冰淇淋）和大包装的食品（如大桶装冻蛋白）。
这种情况下，假定微生物随机分布在样品中，这些样品又是由给定大小的单元组成的（如10g或25g）。为了检测其中的微生物，必须抽取一定数量的样品，如n个。那么阳性样品（至少有一个可疑菌）在整批食品中的比例，可以通过下式计算，n为n个抽样单元中至少有一个阳性单元的抽样个数。
该公式由p=1-（1-d/100）n导出：当d表示抽样量在整批食品中的百分数时，该公式表示抽取n个样品时，至少出现一个阳性样品的可能值。当n在整批食品中仅占一小部分（小于1/4）时，这个关系式成立。
例如：假设我们取了6个样品，每个样品25g，准备检测其中的微生物：概率水平取95%。
也就是说，如果所有检测样品均为阴性，那么在95%的概率下，25g样品的阳性率在整个批次中占的比例不超过39.3%（换句话说，即每2.5kg样品中的细菌数不超过40个）。
例如，假定我们检测这样一批食品，要求以95%的概率，每500g食品中含沙门氏菌小于1个。应该取以25g为单元的样品多少个，才能保证食品符合要求？500g样品中含20个25g的单元。这样上述要求等效于每25g样品中阳性率应小于5%（如在整批食品中任取20个单元，阳性单元数应小于1个）。
即我们需抽取59个样品，每个样品25g，所有这些样品必须为阴性，才能保证从长远考虑每500g食品（95%概率）中所含沙门氏菌小于1个。
2.质征取样与菌落计数或最近似值计数法
一般说来，进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样；进出口贸易合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定抽样方案。目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案，有时也可参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单位包装件数N的开平方值抽样。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。
ICMSF推荐用三级质征取样计划（以下简称三级法）进行菌落计数，并将其作为该协会推荐的基础标准，广泛适用于食品检测。用三级法代替以上提及的用“是/否”为结果的二级法，能将结果分为三个等级，分别是：可接受，勉强可接受，完全不可接受。二级计数与两个临界值有关，可以很方便地用m和M表示。任何超出不可接受值下限的计数都表示整批样品不可接受，“勉强接受”计数的比例在一定范围内时，该批样品为可以接受。三级法结合一般活菌计数、大肠菌群计数等，要求随机抽取多个样品，其优点之一是，样品是否可接受的概率受样品中微生物分布特性的影响较二级法的小。
（1）ICMSF的采样设想 所抽样品的数量、大小和性质对于分析结果会产生很大影响。在某些情况下用于分析的样品可能代表所抽“一批”（lot）样品的真实情况，这适合于可充分混合的液体，如牛乳和水。
在“多批”（lots或batchers）食品的情况下就不能如此抽样，因为“一批”容易包含在微生物的质量上差异很大的多个单元。因此在选择抽样方案之前，必须考虑诸多因素（ICMSF，1986），包括：
――检验目的
――产品及被抽样品的性质
――分析方法
ICMSF提出的采样基本原则，是根据①各种微生物本身对人的危害程度各有不同；②食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度；危害度未变；增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同采样数。目前，加拿大、以色列等很多国家已采用此法作为国家标准。在进行详细叙述之前，先解释4个代号：
n：系指一批产品采样个数。
c：系指该批产品的检样中菌数，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。
m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。
M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。
（2）ICMSF的采样方法 有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、с及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。
①二级抽样方案：自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的来判定该批是否合格。以生食海产品鱼为例n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。
②三级抽样方案：设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。
③ICMSF对食品中微生物的危害度分类与抽样方案说明：为了强调抽样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的抽样计划与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。
ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。
（3）抽样方法
确定了抽样方案以后，抽样方法对抽样方案的有效执行和保证样品的有效性和代表性至关重要。抽样必须遵循无菌操作程序，抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必须清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。应注意确定检验批产品的均质性和来源，确保检样的代表性。常见的抽样方法有以下几种：
①直接食用的小包装食品：尽可能取原包装，检验前不要开封，以防污染。
②统装或大容器包装的液体食品：抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品，装入灭菌盛样容器的量，不应超过其容量的3/4，以便于检验前将样品摇匀；取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至0～4℃。
③统装或大容器包装的固体和固体食品：每份样品应用灭菌抽样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内；注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。
④统装或大容器包装的冷冻食品：对大块冷冻食品，应从几个不同部位用灭菌工具抽样，使之有充分的代表性；在将样品送达实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。
⑤生产过程中的抽样：划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性；如用固定在储液桶或流水作业线上的抽样龙头抽样时，应事先将龙头消毒；当用自动抽样器取不需要冷却的粉状或固定食品时，必须履行相应的管理办法，保证产品的代表性不被人为地破坏。
（四）非随机取样
我们通常希望通过随机取样获得样品。例如可使用随机取样表抽取一条生产线或仓库中的样品，用表中的数字确定不同的取样时间和地点。但生产中会出现很多特殊情况，如在加工熟食品时，细菌数会随生产程序而增多；分装食品的管道系统不清洁或开始生产前未充分洗净，最开始生产的产品细菌数就会很高；传送食品的管道温度适于细菌生长，则在传送过程中细菌数会逐渐增加。
另外，当整批食品储存条件相同，采用随机取样比较合理。但对于一堆食品，其储存温度和其他条件往往都是变化的。在这种情况下，从不同部位取样，获取的信息就不同。如果对环境条件进行同步检测（如用多功能记录仪和几个温度计检测整批食品储存温度的变化），环境变化对微生物的影响就能被检测出来。
食品生产中的微生物检测是为了验证各生产环节的控制效果[如对一个具体的生产线要求建立危害分析和关键控制点（HACCP）并对其进行确认]。为了准确确认危害、危害发生点和建立关键控制点，取样时必须认真。
（五）样品的标记、保存和运送
抽样过程中应对所抽样品进行及时、准确的标记；抽样结束后，应由抽样人写出完整的抽样报告，使样品尽可能保持在原有条件下迅速发送到实验室。
1.样品的标记
（1）所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。
（2）当样品需要送检或由非专职抽样人员运送时，必须密封并标识样品容器。
2.样品的保存和运送
（1）在实验室检测之前，必须维持样品本来的状态。例如冰冻食品要用干冰或冰袋保持冰冻状态（防止食品暴露在二氧化碳气体中），并使用密封容器运输到实验室，检测前要始终保持冷冻状态；易腐烂的非冷冻食品在检测前不应冷冻保存（除非不能及时检测），但如需要短时间保存，应在4℃的温度下冷藏。不过切记，当冷藏时间达到或超过3d时，嗜冷细菌将在食品中生长，同时也可能导致嗜中温细菌死亡；其他食品可放在常温冷暗处。
（2）对所有样品的来源、运输和储存过程都应进行记录。写明采样的条件、日期、地点及其他需要说明的情况，并由检验人签字。
综合训练
结合实习工厂实际生产情况设计某一种产品的取样抽检方法，并对其微生物指标进行检测。
