实验目的
了解和掌握乳品厂加工过程各个环节卫生状况的检测方法、对工厂总体的微生物评估方法，尤其是对卫生设施的布局和加工方法的评估。
实验原理
食品加工行业良好的卫生状况主要取决于良好的卫生设施及其合理的布局，另外，也要重视有效的清洗和消毒措施。
预先对加工过程各个环节卫生状况进行的检测，对工厂总体的微生物评估，尤其是对卫生设施的布局和加工方法的评估十分有效。同时还应注意设备的整体情况、食品中的残留和生产的规模。所有这些观测到的资料均应做好记录，以便与后续的检测工作衔接。
比较未对设备进行消毒处理时生产的食品（从适当的点取样）以及设备经过清洗和消毒后所生产的食品的微生物检测结果，可获得设备上微生物存在状况的信息。这一方法适用于输送液体物料（即管道输送的牛乳、汤和果汁等）的食品加工设备。样品应进行需氧嗜温菌计数和大肠菌群计数的检测，根据情况也可检测其他微生物。
当需要某一特定容器或设备的某一部件的详细信息时，可以用淋洗取样方法。如对混乳器、罐头桶、瓶子和纸盒等的检测，可取适量的淋洗液对管道淋洗后进行检测，便可获得管道安装情况的信息。
当检测设备大配件（如大桶）的特定表面或对不适于淋洗的设备或部分设备（如传送带和切割铁砧）的微生物状况时，可采用棉拭子法取样。
对使用了化学消毒剂的设备取样时，要在淋洗液或棉拭子的25%Ringer氏稀释液中加入适当的消毒剂失活物质（如0.05%硫代硫酸钠）。
淋洗液和棉拭子稀释液中微生物种类和数量的检测包括用非选择性培养基进行菌落计数和用适当的选择性培养基检测大肠菌群和其他菌群。将稀释液在实验室经巴氏消毒后还能检出耐热微生物的数量。但建议在热处理前在稀释液中加入无菌分离的乳液（即5mL的无菌乳加到5mL的稀释液中）。
可用滤膜技术检测淋洗液和棉拭子稀释液。与传统方法相比，这个方法的优点是能够检测大量的稀释液。
通过无菌操作方法将一定面积的涂抹纸与被检测的接触面进行特定面积的涂抹接触处理，然后进行细菌菌落总数和大肠菌群的测定，并以此结果作为被检面含菌程度的检查结果，由此来推测乳品生产企业的卫生管理状况。表面微生物的数量主要受到淋洗和擦拭操作的影响，所以为了取得具有比较价值的实验结果，取样时必须严格地按照标准程序进行。
实验内容
（一）工厂、设备、工作台面的检测
1.棉拭子法
用于检测设备的任一部分，应在多个区域进行擦拭，对难以评估清洁程度的区域（即已清洗过的管道的阀门和接口处）取样时应格外小心。
（1）准备棉拭子 可使用脱脂棉或藻酸盐棉拭子，或选用非药用带状纱布做成较大的拭子，即将15cm长、5cm宽的带状纱布缠到一个30cm长的不锈钢丝上（钢丝长为35cm，直径为3mm）。在一端做一个环，在另一端弯出槽口，以保证纱布在取样时不滑脱。脱脂棉或纱布拭子应放在合金和不锈钢管中，管中装有定量的25%Ringer氏溶液（如果设备上用化学消毒剂，Ringer氏溶液中还应加有失活剂）（附录III）。
（2）用棉拭子擦拭取样 擦拭取样时，尽可能选择大于100cm2的取样面积。擦拭前将拭子靠着容器的边挤压，挤出多余的液体。平行反复地擦拭表面并慢慢地转动拭子，接着用同样的方法进行第二次擦拭，但擦拭的方向与第一次的方向垂直，擦拭后，将拭子放入试管。
（3）棉拭子的检测 取样必须在6h内完成，并尽快检测完毕。若使用脱脂棉拭子或纱布拭子取样，拭子在Ringer氏溶液中至少放置5min后才能检测，且要在Ringer氏溶液中用力地旋转拭子6次，使之混匀。再制备所需浓度的稀释系列。在计数琼脂平板上进行需氧嗜温菌计数，30℃培养3d，同时检测大肠菌群和其他有检测意义的菌群（如嗜热芽孢菌）。
（4）结果分析 棉拭子法结果分析。
大肠菌群计数用于运输、分装或放置热加工食品的设备，每100cm2表面大肠菌群数应小于10个。当100cm2表面上没有发现大肠菌群时则认为设备是卫生的。
2.淋洗法
较小的设备或器具（如桶）可用500mL25%Ringer氏溶液淋洗。对使用过化学消毒剂的设备取样时，冲刷液中应含有相应的失活剂（如0.05%硫代硫酸钠）；当清洁过的管道系统用淋洗法取样时，需要注入大量的无菌冲刷液，然后取部分液体进行检测。
奶牛场的挤乳器可用静态或振动淋洗取样。静态淋洗是用淋洗液对乳头杯和长的管道自然淋洗；振动法与静态法相似，只是用机械泵操作，使乳头杯和套管产生振动。后一种方法的优点是更加符合实际的挤乳操作。
取样必须在6h内完成。按规定的温度和条件进行运输并做好记录，并尽快进行检测。用淋洗法取样检测菌落总数、大肠菌群并进行其他菌的选择性计数。设备部件或小的器具在淋洗取样后要计算每个容器的菌落数，并根据设备条件和设备类型等制定不同的标准。建议制定标准前先检测设备在清洁条件下得到的细菌数。
3.涂抹影印法
（1）材料
①试剂：无菌生理盐水、革兰氏染色液。
②器材：三角瓶、无菌培养皿、无菌移液管、载玻片。
③培养基：菌落总数和大肠菌群测定所用的培养基[营养琼脂（培养基4）、单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管（培养基66）、伊红美蓝琼脂（EMB）（培养基71）、乳糖发酵管（培养基67）]。
④其他：涂抹纸、75%的酒精棉球、消毒镊子、恒温箱、恒温水浴等。
（2）流程
①进入车间先经过消毒池消毒；
②在洗手池洗手消毒；
③涂抹前用75%的酒精棉球消毒手和镊子；
④用消毒镊子取25cm2湿润无菌涂抹纸，贴于被涂抹物表面，使之充分接触，贴完50cm2后，立即放入装有50mL无菌生理盐水的三角瓶中，盖好瓶塞，使涂抹纸与盐水充分混合并做好标识，在4h内进行菌落总数和大肠菌群的测定。
（二）清洗后的瓶子和食品容器的检验
1.原理
用灭菌的胶塞盖上洗过的瓶子，淋洗取样后应尽快检测，最好在取样后6h之内开始检测。食品的容器取样后应盖上盖子或密封以防污染。取样时可参照下文介绍的瓶子的操作步骤进行。
2.淋洗法取样检测
加20mL含有0.05%硫代硫酸钠溶液的25%无菌Ringer氏溶液后盖好瓶塞。在手中水平拿好瓶子，轻轻地沿一个方向旋转12圈，以便内表面完全被湿润，将瓶子竖放15～30min，再沿另一个方向轻轻旋转12圈，使内表面完全被湿润。
用适当的培养基进行需氧嗜温菌计数：奶瓶的检测使用平板计数琼脂或酵母浸膏乳琼脂；果汁瓶的检测用橘汁血清琼脂。另外用多管技术进行大肠菌群计数。将平板在25～30℃培养3d，记录每个瓶子的菌落数和大肠菌群数。
3.容器内污染物培养法
检查洗净的玻璃瓶中是否存在污染微生物的方法是将一定量熔化的琼脂培养基倒入瓶内，将瓶子水平放置缓缓地滚动直到琼脂在内壁凝固，在瓶的内表面形成一层5mm厚的琼脂层（也可将加有熔化琼脂的瓶子放在盛有冰水混合物的浅盘中滚动以加快琼脂的凝固）。取下瓶子的瓶塞培养，和滚动试管的培养方法一样。培养后通过观察琼脂是否产生破裂或陶瓷状破损表面来证明。
4.大容器的检测
用于输送和储存牛乳、冰淇淋、糖浆、果汁等较大的罐和桶，可用500mL灭菌的25%Ringer氏溶液淋洗取样后进行检测。
（1）挑选和感官检查 乳罐和大桶取样后的淋洗液应在0.5～1h内检测。首先，进行感官检查和记录总的状况，尤其是以下几点：①坏缺口、生锈、裂缝或盖子损坏等；②是否存在细丝状物、水垢以及食物或牛乳结块；③记录乳搅拌器的湿度，即干燥、潮湿、湿（在罐头或乳搅拌器的底部有明显的水存在）。
若罐或乳搅拌器中含有浊水、可去除的食物或牛乳结块，不经检测就可判为不合格；但其中的丝状物或水垢要经检测后才能判断。
（2）淋洗取样 打开罐盖，倒入500mL无菌的25%Ringer氏溶液，盖好盖。将罐水平放置，接着来回滚动12圈，然后将罐竖直放置5min，再滚动12圈，将淋洗液倒入取样用的无菌容器中。
（3）淋洗液的检测 取样后6h内尽快进行检测。慢慢翻转容器3次混匀样液，在预先加入计数琼脂、酵母浸膏乳琼脂（培养基61）或其他适当的培养基上加入1mL和0.1mL样液，涂布均匀，30℃培养3d。选101、100、10-13个梯度（大于1mL的接种液应使用双料培养基）用多管技术法检测是否存在大肠菌群。对装有糖浆、果汁等的罐和均质器的样液进行霉菌、酵母菌计数并记录每罐的结果。
5.结果分析
容器检测的微生物学标准。
（三）空气的检验
1.原理
检测牛乳加工厂的空气是非常必要的，因为空气中可能存在特定的微生物，尤其是存在霉菌污染的情况下，真菌孢子会通过空气传播。如果要查明污染源，可用简单的落菌试验：将盛有培养基的平皿放在不同的位置，在空气中暴露15min。15min内落在每个平皿上的细菌数代表大约0.1m2/min的细菌数。跟踪记录不同微生物的菌落数可能会找出污染的关键点。下次到工厂调查时，就可找到传染源和制定合适的补救措施。
取样时，不必使用狭缝取样器或类似的工具（尽管它们能对空气中微生物准确计数），而这时最好使用膜过滤器。将灭菌营养琼脂平板在检测目的地暴露一定时间，暴露面朝向测试表面（即工作表面）在一个30cm的范围内来回擦10次，然后重新盖盖，将这一平板和暴露于空气的平板一起培养。通过（36±1）℃温箱内培养（48±2）h，来推测被测目的地的空气中所存在微生物的数量。这项技术可实现定量检测，但它更适用于验证不经常清洗的水池表面的微生物及所采取的消毒措施的有效性。
2.材料
熔化并冷却至46℃的营养琼脂（培养基4）、无菌平皿、（36±1）℃温箱等。
3.步骤
（1）在无菌条件下，把冷至46℃的灭菌营养琼脂倾入灭菌平皿内。
（2）待完全凝固后，置检测目的地暴露15min。
（3）翻转平板置（36±1）℃温箱内培养（48±2）h。
（4）计数并记录结果。
4.注意事项
（1）检测时一定要使平皿完全暴露在空气中。
（2）检测完要及时进行温箱培养。
（3）检测时要保证时间的准确性。
（四）工厂排水中沙门氏菌的检验
调查食品加工厂（如禽类或肉类加工厂）及其附属建筑中沙门氏菌污染的危害特点时，可使用安装在下水道或排水管中等关键点的阴沟拭子取样。将2m长的细线系到拭子上（拭子可以是对折的纱布或洁净毛巾），用纸包起来，放入高压锅中灭菌。在现场将拭子悬挂在所选的下水道或其出口处，确保这根线留在这个位置1～7d。另选一拭子涂抹下水道表面，然后立即送往实验室。延长暴露时间可以增大检出沙门氏菌的可能性，但也增加了其他微生物污染的程度。通常暴露的时间越长，增菌培养的时间就越长（在划线前，需要将严重污染的拭子液体增菌两次）。
将拭子送到实验室之后，在亚硒酸盐增菌液（培养基102）中培养。将拭子放入一个无菌塑料袋，然后剪开袋子的一个角，将拭子上吸收的液体用力压，并收集到一个无菌容器中（将无菌的硫代硫酸钠加进去，以便中和残留氯）。分别取10mL液体加入90mL亚硒酸盐增菌液、氯化镁孔雀绿增菌液（培养基84）和GN增菌液（培养基80）中。也可以将拭子放在广口瓶（或送样瓶）中，加入750mL亚硒酸盐增菌液，但这样做不能对拭子多次增菌。
这种选用污水管拭子检测沙门氏菌的方法比对成品检测更快更方便。一旦检出沙门氏菌，可再返回去对产品进行详细的检测，以查明污染源。
实验结果与报告
将检测结果记录。
综合训练
结合你实习的工厂，按上述方法对车间的空气、操作者的手、工作台和食品容器的微生物污染情况进行评估。
