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第46章 实验43 双歧杆菌和酿酒酵母原生质体的融合

实验目的

学习并掌握原生质体的制备、再生及融合技术。

实验原理

原生质体融合(protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁,使之形成原生质体,然后在高渗的条件下混合,并加入物理的或化学的或生物的助融条件,使双亲株的原生质体间发生相互凝集,通过细胞质融合,核融合,进而发生基因组间的交换重组,可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程。

所用的助融剂聚乙二醇(PEG)是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的镶嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层,在Ca2+存在下引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到两个原生质体全部融合。一般以PEG1000~6000较为适用,不同种类微生物对PEG相对分子质量的要求不尽相同。放线菌适用相对分子质量常为1000~1500,也有人使用4000~6000,真菌一般采用4000~6000,细菌用1500~6000.PEG常用浓度为30%~50%,但随微生物种类不同而异,实际工作中要做预备实验。酵母菌原生质体融合时采用低浓度的PEG,常用浓度在20%~35%,真菌在30%左右效果较好,低于20%失去稳定性,导致原生质体破裂,高于30%会引起原生质体皱缩,过高还会产生中毒现象。

双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和动物肠道内最主要的生理性细菌之一,具有抗感染、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、改善免疫功能等促进作用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevi-siae)用于酿造啤酒、酒精、发酵面包及其他饮料酒。本实验通过原生质体融合技术,将厌氧双歧杆菌和酵母进行原生质体融合,采用10%乳糖中性红培养基进行融合子的初筛,并分析融合子传代稳定性、生物学特性,从而改善了双歧杆菌的耐氧性。

一些试剂,如EDTA、甘氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、2-脱氧葡萄糖、Triton X100、青霉素等,在一定范围内可增加菌体细胞壁对酶的敏感性,促进原生质体的释放。因此,在双歧杆菌培养时,培养基中加入0.1μg/mL青霉素,以提高其酶解效果。选用0.1mol/L EDTA配制的0.4%(体积分数)β-巯基乙醇作为酵母预处理剂,酶解前处理原生质体。

实验材料

(一)菌种

两歧双歧杆菌(Bifdobacterium bifdum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

(二)培养基

(1)TPY培养基(培养基13)。

(2)再生TPY培养基 培养基PYG1L、甘露醇91g、葡萄糖10g、琼脂18g。

(3)液体完全培养基(YPD)蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母膏10g、蒸馏水1L,pH6.5.

(4)固体完全培养基YPD+2%的琼脂。

(5)再生YPD YPD 1L、甘露醇91g、葡萄糖10g、琼脂18g。

(6)乳糖中性红培养基 蛋白胨20g、乳糖100g、酵母膏10g、0.5%中性红5mL、蒸馏水1L、pH7.2.

(7)选择性培养基 乳糖中性红培养基1L、甘露醇91g、琼脂18g。

上述培养基均采用0.1MPa,20min灭菌。

(三)试剂

(1)0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液(PB)。

(2)高渗溶液0.5mol/L甘露醇(用PB配制),5mg/L DNA酶(微孔过滤除菌后加入)。

(3)原生质体稳定液0.5mol/L蔗糖,0.02mol/L MgCl2,0.02mol/L顺丁烯二酸,pH6.5.

(4)预处理剂 用0.1mol/L EDTA配制的0.4%(体积分数)β-巯基乙醇。

(5)促融剂 用高渗溶液配制的35%聚乙二醇(PEG6000)。

(6)脱壁酶 溶菌酶(Lysozyme)、蜗牛酶(Snailase)、纤维素酶(Cellulase),使用时按所需浓度用高渗溶液配制,微孔过滤除菌。

上述溶液(已注明的除外)均采用0.1MPa,20min灭菌。

实验流程

活化菌种→收集菌体→菌体预处理→酶解脱壁→原生质体再生→原生质体融合→融合子筛选

实验步骤

(一)菌体培养

(1)短双歧杆菌 自新鲜斜面(TPY固体培养基)挑取一环接入TPY液体培养基,37℃厌氧培养24h,将活化好的菌种以1%接种量再接入TPY液体培养基试管中,37℃厌氧培养20~22h至对数生长期,离心收集菌体备用。

(2)啤酒酵母 自新鲜斜面上取菌体一环接种于5mLYPD试管中,30℃活化24h,转接入装有50mLYPD的锥形瓶中,30℃振荡培养16h至对数生长期,离心收集菌体备用。

(二)收集菌体

依次用5mL原生质体稳定液(SMM)和5mL高渗溶液各洗涤离心(3000r/min,10min)一次(酵母先加入EDTA-巯基乙醇预处理剂,30℃保温30min,3000r/min离心)。

(三)原生质体的制备与再生

将离心后的菌体悬浮于5mL高渗溶液中,加入适量酶液(双歧杆菌用溶菌酶,酵母用蜗牛酶+纤维素酶),在设定的温度下酶解一定时间,再用高渗溶液洗涤2次,悬浮于高渗溶液中备用。

同时做酶解前菌落计数(双歧杆菌用PYG培养基、酵母菌用YPD培养基)、酶解后再生菌落(双歧杆菌用再生PYG培养基、酵母菌用再生YPD培养基)及蒸馏水处理原生质体后平板计数(未形成原生质体菌数,双歧杆菌用PYG培养基、酵母菌用YPD培养基),并计算原生质体形成率和原生质体再生率。

(四)原生质体的融合

将亲株原生质体与高渗液等体积混合,4000r/min离心10min,弃上清液后,加入5mL 35%PEG6000,37℃轻轻摇动融合30min后,4000r/min离心10min,高渗溶液洗涤2~3次,用原生质体稳定液稀释后,取0.1mL夹层培养于选择性培养基中,30℃培养4~5d。

(五)融合子的筛选

根据短双歧杆菌和酿酒酵母在分解乳糖上的差别(短双歧杆菌分解乳糖,啤酒酵母不分解乳糖),设计了乳糖中性红培养基作为选择性培养基,用于融合子的筛选。30℃培养48h后长出的红色菌落可疑为双歧杆菌和酿酒酵母融合子。

(六)DNA的提取及(G+C)%(摩尔分数)测定

DNA的提取采用苯酚氯仿混合提取法;DNA的(G+C)%测定;采用熔链温度测定法(Tm)。

(七)融合子的稳定性

由于核融合二倍体能够稳定遗传而异核体则很快会出现分离现象,因此,将上述选择培养基夹层培养长出的融合子菌落,在乳糖中性红培养基平板上有氧条件下连续传代10次(加适量对氟苯丙氨酸PFA处理,加速不稳定融合子的分离),从中筛选出稳定遗传的融合子。

实验结果与报告

(1)绘图说明菌体、原生质体及加入助融剂后原生质体的形态。

(2)计算融合两亲本原生质体的形成率和再生率。

思考题

(1)哪些因素影响原生质体再生?如何提高再生率?

(2)如何挑选出融合子?

(3)PEG助融剂有何作用?

(4)在融合子筛选中如何区分是形成异核体还是形成重组融合子?

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