一、紫外线诱变筛选高产酸的酸乳发酵菌株
实验目的
（1）学习并掌握紫外线物理诱变育种的原理和方法。
（2）观察紫外线对乳杆菌高产乳酸的诱变效应。
实验原理
诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究使用。酸乳质量的好坏，决定于菌种的性能；筛选出产酸力、感官、黏度等性能指标优良的菌株，对生产高质量的酸乳意义重大。
本实验采用最常用而简便有效的紫外线（简称UV）物理诱变剂筛选淀粉酶活力高的菌株。紫外线诱变最有效的波长为250～270nm，在260nm左右的紫外线被核酸强烈吸收，引起DNA结构变化。一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如引起DNA链或氢键的断裂、DNA分子内或分子间的交联、核酸与蛋白质的交联、胞嘧啶的水合物作用。但其最主要的作用是形成胸腺嘧啶二聚体。若在同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，将阻碍碱基间的正常配对；若在两条DNA链之间形成胸腺嘧啶二聚体，将阻碍DNA的复制，或引起碱基序列的变化。最终导致复制突然停止或错误复制，轻者引起基因突变，重者造成死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活。因此，经紫外线照射后的菌液必须在暗室或红灯下进行操作或处理，培养时需用黑纸或黑布包裹，避免可见光的照射。此外，照射处理后的菌液不要储放太久，以免突变在黑暗中修复。
实验材料
（一）菌种
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp。bulgaricus，Lb）。
（二）培养基
脱脂乳培养基（培养基18）、MRS培养基（培养基14）。
（三）仪器与其他用品
无菌平皿（φ6cm2套、φ9cm40套）、无菌离心管（10mL）、无菌吸管（1mL、5mL）、三角瓶、试管、量筒、烧杯、紫外灯箱（紫外灯15W，距离30cm）、磁力搅拌器、无菌磁力搅拌棒、台式离心机、培养箱、振荡培养箱、接种环、玻璃涂布棒、酒精灯、火柴、记号笔、黑布或黑纸、红灯等。
实验流程
制备菌悬液→活菌计数→UV处理→稀释涂平板→计算存活率和致死率→观察诱变效应
实验步骤
（一）菌悬液的制备
挑取Lb原种转接于新鲜MRS斜面上，经40℃活化培养24h后，加入无菌水5mL，刮下表面培养物制成菌悬液，在旋涡混合器上振荡30s，以打散菌团，用显微镜直接涂片计数法计数，调整菌悬液的细胞浓度为108个/mL。
（二）菌悬液的活菌计数
取菌悬液1mL按10倍稀释法逐级稀释至10-7，取10-5、10-6、10-7三个稀释度各0.1mL移入MRS琼脂培养基平板上（作为对照平板），用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂2个平板，置40℃培养48h后进行菌落计数。根据平均菌落数计算诱变处理前1mL菌悬液内的活菌数，据此数再计算诱变处理后的存活率和致死率。
（三）紫外线诱变处理
打开紫外灯预热约20min。分别吸取菌悬液5mL移入2套6cm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒，置磁力搅拌器上，距15W紫外灯下30cm处。打开磁力搅拌器，再打开皿盖，开始计时，边搅拌边照射，照射剂量分别为150s、300s。盖上皿盖，关闭紫外灯。所有操作必须在红灯下进行。
（四）稀释涂平板
在红灯下分别取150s和300s诱变处理菌悬液1mL于装有9mL无菌生理盐水的试管中，按10倍稀释法逐级稀释至10-4，取10-2、10-3、10-4三个稀释度（150s和300s处理）各0.1mL移入MRS琼脂培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂2个平板。用黑布或黑纸包好平板，于40℃避光培养48h后进行菌落计数。根据平均菌落数计算诱变处理后的1mL菌液内的活菌数。注意：在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。
（五）计算存活率和致死率
将培养好的平板取出进行菌落计数。根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理150s和300s后每毫升菌液中的活菌数。
（六）筛选方法
1.初筛
挑取筛选培养皿中黄色的、生长较快的菌株，接种于脱脂乳试管中，每株1支，再取凝乳较快的菌株，进行酸乳摇瓶发酵试验，菌株按3%接种量接入到固形物为11%的灭菌乳中，42℃培养，重点观察凝乳时间、乳清析出情况、组织状态，经过多次实验，最终淘汰凝乳时间长，乳清析出严重，凝乳不良的菌株。
2.复筛
选取初筛产酸活力较高的菌株，接种到脱脂乳中，每株3支，精确测定产酸能力和产乳糖酶能力，选出高产酸菌株。
（七）诱变效应的测定
本实验采用直接测定各变异菌株产酸性、乳糖酶活性、pH变化的方法，检测其诱变效应。
（八）高产酸菌株的稳定性试验
将诱变菌株连续传代发酵，每次传代都要进行酸度的测定，观察产酸的稳定性。
注意事项
（1）紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。应戴防护眼镜，以防紫外线灼伤眼睛。
（2）诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。
实验结果与报告
将实验结果按表要求如实，并分别计算出存活率和致死率。
思考题
（1）紫外诱变处理中，为什么在红灯下进行操作？
（2）紫外照射时，为什么要打开平皿盖？照射处理后的平板为何要置黑暗中培养？
二、亚硝基胍诱变筛选高产丁二酮的乳酸乳球菌菌株
实验目的
（1）学习并掌握亚硝基胍化学诱变育种的原理和方法。
（2）观察亚硝基胍对乳球菌高产丁二酮的诱变效应。
实验原理
许多化学因素如亚硝基胍（NTG）、亚硝酸（HNO2）和硫酸二乙酯（DES）等，对微生物都有诱变作用。其中亚硝基胍（NTG）是一种烷化剂，能直接与DNA中的碱基发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基的颠换，进一步使微生物发生变异，引起遗传性状的改变。
乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种可以利用柠檬酸盐产生一些代谢产物，其中包括丁二酮（双乙酰）。丁二酮是许多乳制品中的重要风味物质，在乳品工业中具有很重要的应用价值。但野生菌株或常用于乳制品的菌株在生产过程中丁二酮产量较低，满足不了生产要求。为了提高丁二酮的产量，本实验以乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种为出发菌株，以亚硝基胍（NTG）为诱变剂筛选高产丁二酮的乳酸乳球菌菌株，并计算丁二酮的产量。
实验材料
（一）菌种
乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（Lactococcus lactis subsp。lactis biovar diacetyl）。
（二）培养基
GM17培养基（M17培养基+0.5%葡萄糖）。
（三）仪器与其他用品
无菌平皿、无菌离心管（10mL）、无菌吸管（1mL、5mL）、三角瓶、试管、台式离心机、培养箱、振荡培养箱、恒温培养箱、接种环、玻璃涂布棒、记号笔等。
（四）试剂
（1）亚硝基胍（NTG）溶液 在通风橱中称取25mg NTG于棕色瓶中，加2.5mL丙酮使其溶解，溶解后加水10mL，配制成2.5mg/mL NTG溶液。
（2）丙―酸盐缓冲溶液K2HPO4150g/L，丙酮200mL/L。
（3）FeSO4溶液FeSO4□7H2O 50g/L，H2SO4 10g/L。
（4）酒石酸钾―水溶液NH3□H2O 300mL/L，酒石酸钾钠375g/L。
（5）丁二酮标准溶液 称取500.0mg丁二酮，溶于1000mL双蒸水中，用棕色瓶储于冰箱内，临用前吸取5.00mL，稀释成1000mL，浓度为0.25mg/mL。
实验流程
制备菌悬液→活菌计数→NTG处理→稀释涂平板→计算存活率和致死率→观察诱变效应
实验步骤
（一）菌悬液的制备
挑取乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种活化后，在5mL GM17培养基中30℃培养18～24h，6000r/min离心10min，收集菌体，用PBS（100mmol/L，pH7）冲洗1次，加入0.5mL PBS制成菌悬液，在旋涡混合器上振荡30s，以打散菌团，用显微镜直接涂片计数法计数，调整菌悬液的细胞浓度为108个/mL。
（二）菌悬液的活菌计数
取菌悬液1mL按10倍稀释法逐级稀释至10-7，取10-5、10-6、10-7三个稀释度各0.1mL移入GM17琼脂培养基平板上（作为对照平板），用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂2个平板，置40℃培养48h后进行菌落计数。根据平均菌落数计算诱变处理前1mL菌悬液内的活菌数，据此数再计算诱变处理后的存活率和致死率。
（三）NTG诱变处理
加入0.5mL NTG溶液，置30℃分别摇床振荡处理30min和60min，NTG浓度调整为致死率75%左右。
（四）中止反应
将NTG处理过的菌体离心，用PBS冲洗3次以除去NTG残留。
（五）稀释涂平板
使菌体悬浮于5mL GM17液体培养基中，30℃培养60min，最后将菌悬液振荡2min，稀释到10-4，取10-2、10-3、10-4三个稀释度（30min和60min处理）各0.1mL移入GM17琼脂培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂2个平板，30℃培养60h。注意：为了便于筛选，平板中的琼脂层较薄为好（约12mL），培养的菌落较大而且分散要好（每个平板中菌落数约60个，直径约2mm）。
（六）计算存活率和致死率
将培养好的平板取出进行菌落计数。根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出NTG处理30min和60min后每毫升菌液中的活菌数。
（七）筛选方法
由于筛选过程会使菌体死亡，所以需要把长好菌落的平板先用绒布影印培养，向每个平板中添加60℃的3mL琼脂（50g/L），3mL盐酸羟氨溶液（210g/L），待琼脂层凝固后置于75℃，30min，以形成丁二酮肟盐，然后向平板中添加8mL丙―酸盐缓冲溶液，15min后将液体倒掉，在暗处向平板中加入8mL FeSO4溶液和1mL酒石酸钾―水溶液，检查平板，在菌落周围形成红色圆圈（丁二酮肟铁酸盐）的为高产丁二酮菌株，显色反应可保持1h，10min时最为明显。
（八）诱变效应
将菌种活化后，取0.1mL菌液接种于50mL 12%脱脂乳中，在振荡培养箱中30℃振荡培养（100r/min）24h后，测定丁二酮产量（邻苯二胺比色法）。
（九）菌株稳定性实验
对挑选出的菌株传代5次，分别进行脱脂乳发酵24h，检测丁二酮产量。
实验结果与报告
将实验结果按要求如实填入，并分别计算出存活率和致死率。
思考题
用化学诱变处理细菌时，其菌悬液为什么要用缓冲液制备？
