实验目的
（1）了解金黄色葡萄球菌检验原理。
（2）掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法。
实验原理
葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品（剩饭、糕点、牛乳、肉品等）以及人和动物的体表黏膜等处均有存在，大部分是不致病的，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种，可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险。检查乳及乳制品中金黄色葡萄球菌及数量对于乳品生产具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固。多数金黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
实验材料
（一）样品
乳、肉、蛋、鱼制品和饮料等。
（二）菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。
（三）培养基与试剂
7.5%氯化钠肉汤（培养基85）、血琼脂平板（培养基100）、Baird-Parker氏培养基（培养基73）、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。
（四）仪器及其他用品
显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。
实验流程
金黄色葡萄球菌检验流程。
实验步骤
（一）一般培养
称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液（液体样品可不稀释）。吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。同时将对照菌种在上述两种平板上做划线分离接种。置（36±1）℃温箱培养24h。
（二）分纯培养
将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落，先观察对照的菌落特征，再观察被检样品的菌落，并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。若无菌落生长，也可用增菌培养物在上述平板上划线分离，在（36±1）℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。
（三）形态特征
本菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径为0.5～1μm。在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板菌落呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上为圆形，光滑凸起，湿润，直径2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
（四）血浆凝固酶试验
挑取上述可疑菌落菌种于肉浸液肉汤，同时将金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌分别接种于肉浸液肉汤，在（36±1）℃温箱培养24h后进行血浆凝固酶试验。
吸取1：4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养基0.5mL，振荡摇匀，放在36℃温箱或水浴内，每0.5h观察1次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时呈现凝块者，被认为是阳性结果，同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
（五）直接计数方法
直接吸取上述1：10混悬液，进行10倍递次稀释。根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L型涂布棒涂布整个平板。如水分多，不易吸收，可将平板放在（36±1）℃1h，等水分蒸发后反转平皿置于（36±1）℃培养。
在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，（36±1）℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。
菌落计数：将三块平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。
实验结果与报告
根据形态特征，血平板情况以及血浆凝固酶试验，判别检样有否金黄色葡萄球菌。
思考题
（1）金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征如何？为什么？
（2）鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标是什么？
