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第23章 实验20 志贺氏菌属的检验

实验目的

(1)了解志贺氏菌属系统检验原理。

(2)理解志贺氏菌属生化反应原理。

(3)掌握志贺氏菌属系统检验方法。

实验原理

志贺氏菌属的细菌,又称为痢疾杆菌。能引起痢疾症状的病原微生物很多,如志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、埃希氏菌属等,还有阿米巴原虫、鞭毛虫及病毒等,其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌的易感性较高,所以在食物和饮用水的卫生检验时,常以是否含有志贺氏菌作为指标。

与肠杆菌科各属细菌相比较,志贺氏菌属的主要鉴别特征为不运动,对各种糖的利用能力较差,并且在含糖的培养基内一般不形成可见气体。除运动力与生化反应外,志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。

实验材料

(一)菌种

某种志贺氏菌(Shigella sp。)、大肠杆菌(E。coli)。

(二)检样

食品检样。

(三)培养基及试剂

GN增菌液(培养基80)、HE琼脂(培养基81)、SS琼脂(培养基97)、伊红美蓝琼脂(EMB)(培养基71)、麦康凯琼脂(培养基88)、三糖铁琼脂(TSI)(培养基96)、半固体肉膏蛋白胨试管(培养基4)、赖氨酸脱羧酶试验培养基(培养基32)、苯丙氨酸培养基(培养基33)、西蒙氏柠檬酸琼脂(培养基52)、葡萄糖铵琼脂(培养基92)、葡萄糖半固体(培养基91)、缓冲葡萄糖蛋白胨水(培养基46)、糖发酵管(棉子糖,甘露糖,甘油,七叶苷及水杨苷)(培养基98)、5%乳糖发酵管(培养基94)、蛋白胨水(培养基35)、尿素琼脂(培养基42)。

氰化钾(KCN)、吲哚试剂、甲基红试剂、V-P试剂、氧化酶试剂及志贺氏菌属诊断血清(见附录III)。

(四)仪器及其他用品

天平(称取检样用)、均质器和乳钵、温箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌三角瓶、灭菌平皿、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、镍铬丝、试管架、试管篓、硝酸纤维素滤膜。

实验流程

志贺氏菌属检验流程。

实验步骤

(一)增菌

称取检样25g,加入装有225mL GN增菌液的500mL广口瓶内,固体食品用均质器以800~10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化,于36℃培养6~8h,培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应终止培养。

(二)分离

取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个,于36℃培养18~24h,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

(三)生物化学试验

挑取平板上的可疑菌落,接种在三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落以防遗漏。志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸,不产气(福氏志贺氏菌6型可微产气),斜面产碱,不产生硫化氢;葡萄糖半固体管内沿穿刺线生长,无动力,具有以上特性的菌株,疑为志贺氏菌,可做血清学凝集试验。在做血清学试验的同时,应做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验,志贺氏菌属均为阴性反应。必要时做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。并用生化试验方法做4个生化群的鉴定。

(四)血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物,做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查。如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集,则用A1,A2,B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原。可先用群因子血清检查,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查。

实验结果与报告

根据实验过程详细记录样品和对照菌种的各项结果,并作出结论报告。

思考题

(1)如何检出食品中的志贺氏菌?

(2)根据培养和生化试验,有否检出志贺氏菌?

(3)根据生化特性和血清学试验,检出的志贺氏菌属哪个群?哪个型?

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