实验目的
（1）了解致病性大肠杆菌的种类与非致病性大肠杆菌的区别。
（2）掌握致病性大肠杆菌检验的原理和方法。
实验原理
大肠杆菌（Escherichia coli）也称大肠埃希氏菌，正常情况下，大肠杆菌不致病，而且还能合成B族维生素和维生素K，生产大肠菌素，对机体有利。但当机体抵抗力下降或大肠杆菌侵入肠外组织或器官时，可作为条件性致病菌而引起肠道外感染。有些血清型可引起肠道感染，已知的引起致病性大肠杆菌有4类，即产肠毒素大肠杆菌、出血性大肠杆菌、肠道侵袭性大肠杆菌和肠道致病性大肠杆菌。带菌的牛和猪是传播本菌引起食物中毒的重要原因，人的带菌亦可污染食品，引起中毒。
实验材料
（一）菌种和食品检样
产不耐热肠毒素（LT）和产耐热肠毒素（ST）大肠杆菌标准菌株、待检样品。
（二）试剂和培养基
多黏菌素B纸片、0.1%硫柳汞溶液、2%伊文思蓝溶液、革兰氏染色液。
乳糖胆盐发酵管（培养基66）、营养肉汤（培养基104）、肠道菌增菌肉汤（培养基76）、麦康凯琼脂（培养基88）、伊红美蓝琼脂（EMB）（培养基71）、三糖铁琼脂（TSI）（培养基96）、克氏双糖铁琼脂（KI）（培养基113）、糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）、赖氨酸脱羧酶试验培养基（培养基32）、尿素琼脂（pH7.2）（培养基42）、氰化钾培养基（培养基93）、蛋白胨水（培养基35）、半固体琼脂（培养基74）、Honda氏产毒肉汤（培养基115）、Elek氏培养基（培养基114）、吲哚试剂、氧化酶试剂（附录III）。
（三）动物和血清
1～4日龄小白鼠，致病性大肠杆菌诊断血清、侵袭性大肠杆菌诊断血清、产肠毒素大肠杆菌诊断血清、出血性大肠杆菌诊断血清，产肠毒素大肠杆菌LT和ST酶标诊断试剂盒，抗LT抗毒素。
（四）仪器及其他用品
天平、均质器或研钵、温箱（36±1）℃、水浴锅、显微镜、离心机、酶标仪、细菌浓度比浊管、灭菌广口瓶、灭菌三角烧瓶、灭菌平皿、灭菌试管、灭菌吸管、橡胶乳头、载玻片、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架、注射器、灭菌的刀子、剪子、镊子、硝酸纤维素滤膜。
实验流程
致病性大肠杆菌的检验流程。
实验步骤
（一）增菌
样品采集后应尽快检验。以无菌操作称取检样25g，加入225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用研钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于（36±1）℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。
（二）分离
将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于（36±1）℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
（三）生化试验
自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素、琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。
TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠杆菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠杆菌。必要时做氧化酶试验或革兰氏染色镜检。
（四）血清学试验
1.假定试验
挑取经生化试验证实为大肠杆菌的琼脂培养物，用致病性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌多价O血清和出血性大肠杆菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。
2.证实实验
制备O抗原悬液，稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160～1：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40.稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做试管凝集试验。混匀后放于50℃水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。
（五）肠毒素试验
1.酶联免疫吸附试验检测LT和ST
（1）产毒培养 将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE（在肠毒试剂内，如果没有，可用Honda氏产毒肉汤）培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多黏菌素B0.05mL，于37℃培养1h，4000r/min离心15min，分离上清液，加入0.1%硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。
（2）LT检测方法（双抗体夹心法）
包被：先在产肠毒素大肠杆菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。
洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液Ⅰ洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。
封闭：每孔加100μL封闭液，于37℃水浴中1h。
洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。
加样本：每孔分别加多种试验菌株产毒培养液100μL，37℃水浴中1h。
洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。
加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴中1h。
洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。
酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光作用5～10min，加入终液50μL。
结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为橘黄色或明显高于阴性对照者为阳性。
（3）ST检测方法（抗原竞争法）
包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。
洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。
封闭：每孔加100μL封闭液，37℃水浴1h。
洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。
加样本及ST单克隆抗体（鼠源性）：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50μL、稀释的ST单克隆抗体50μL（先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混合），37℃水浴1h。
洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。
加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴1h。
洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。
酶底板反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光5～10min，再加入终止液50μL。
结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值。
目测无色或明显淡于阴性对照者为阳性。
2.双向琼脂扩散试验检测LT
将被检菌株按5点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36℃培养48h。在每株菌苔上放多黏菌素B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗入琼脂中，在距5点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30μL，用已知产LT和不产毒菌作对照，经15～20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。
3.乳鼠灌胃试验检测ST
将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36℃培养24h，以3000r/min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30min，每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02mL。将此滤液用塑料小管注入1～4日龄的乳鼠胃内0.1mL，同时接种3或4只，禁食3～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）质量及剩余体质量。肠管质量与剩余体质量之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。
实验结果与报告
（1）通过实验，是否检出致病性大肠杆菌？
（2）综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。
思考题
（1）致病性大肠杆菌有哪几种？主要引起哪几种症状的疾病？
（2）怎样预防致病性大肠杆菌引起的食物中毒？
（3）致病性大肠杆菌的检验程序。
