实验目的
（1）理解沙门氏菌属生化反应及其原理。
（2）掌握沙门氏菌属血清因子使用方法。
（3）掌握沙门氏菌属的系统检验方法。
实验原理
沙门氏菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。其种类繁多，少数能使人致病，其他可使动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒、副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。
食品中沙门氏菌的检验方法有5个基本步骤：①前增菌；②选择性增菌；③选择性平板分离沙门氏菌；④生化试验，鉴定到属；⑤血清学分型鉴定。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。
实验材料
（一）菌种
沙门氏菌（Salmonella sp。）、大肠杆菌（E。coli）。
（二）检样
冻肉、蛋品、乳品等。
（三）培养基
缓冲蛋白胨水（BP）（培养基35）、氯化镁孔雀绿（MM）增菌液（培养基84）、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液（培养基112）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液（培养基102）、SS琼脂（培养基97）、EMB琼脂（培养基71）、亚硫酸铋琼脂（BS）（培养基103）、三糖铁琼脂（TSI）（培养基96）、葡萄糖蛋白胨水（培养基46）、尿素培养基（培养基42）、赖氨酸脱羧酶试验培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基（培养基32）、丙二酸钠培养基（培养基111）、氰化钾（KCN）培养基（培养基93）、ONPG培养基（培养基90）、缓冲葡萄糖蛋白胨水（培养基46）、DHL琼脂（培养基77）、HE琼脂（培养基81）。
（四）试剂
吲哚试剂、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂、沙门氏A～F多价诊断血清、革兰氏染色液等（见附录III）。
（五）仪器及其他用品
天平（称取检样用）、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、三角烧瓶、吸管、平皿、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。
实验流程
沙门氏菌的检验流程。
实验步骤
（一）前增菌和增菌
沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的培养基缓冲蛋白胨水（BP），进行增菌，使濒死状态的沙门氏菌恢复活力。一般增菌时间为4h，增菌时间不宜过长，由于BP培养基中没有抑菌剂，时间太长了，杂菌也会相应增多。干蛋品特殊，蛋品中的主要病原菌为沙门氏菌，其在加工过程中受到的损伤又较严重，因此应适当延长前增菌时间，一般为18～24h。
冻肉及经过加工的蛋、乳制品及其他食品均应经过前增菌，各取检样25g，加入盛有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内（瓶内预放玻璃珠若干粒），塞紧瓶口，充分摇匀。在（36±1）℃培养4h（干蛋品需培养18～24h），移10mL增菌培养物加入氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液，在42℃培养18～24h。同时另取10mL，加入100mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，在（36±1）℃培养18～24h。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g（25mL）加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液，取1/2，接种于100mLMM（或TTB）增菌液内，于42℃培养18～24h；另1/2接种于100mLSC增菌液内，于（36±1）℃培养18～24h。
（二）分离
取增菌液和混合液各1环，分别划线接种于1个BS平板和1个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板或SS琼脂平板）。于（36±1）℃培养18～24h（DHL、HE、SS）或40～48h（BS），观察各个平板上生长的菌落。先观察混合菌种平板，再检查样品平板上有无深色或深色有光泽等特征的可疑菌落，挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。
（三）三糖铁高层琼脂初步鉴别
将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种1支三糖铁高层琼脂斜面，于（36±1）℃培养18～24h，并根据初步判断是否可疑沙门氏菌。
（四）生化试验
在接种三糖铁琼脂的同时，接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于（36±1）℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。
1.反应序号A1
典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。
2.反应序号A2
可先做血清学鉴定，如A～F多价O血清不凝聚时，补做甘露醇和山梨醇试验，按判定结果。
3.反应序号B1
三糖高层斜面产酸的菌株可予以排除，不产酸的应该先做血清学鉴定。如A～F多价O血清不凝聚时，补做鸟氨酸、ONPG、水杨苷、棉子糖和动力试验。按判断结果。必要时按进行沙门氏菌生化群的鉴别。
（五）血清学分型鉴定
1.抗原的准备
一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2.5%～3.0%）培养基上检查，O抗原在干燥环境中发育较好；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查，H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管1或2次，自远端取菌培养后再检查。
2.O抗原的鉴定
用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被A～F多价O血清凝集者，依次用O4，O3.10，O7，O8，O9，O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3.10血清凝集的菌株，再用O10，O15，O34，O19单因子血清做凝集试验。判定E1，E2，E3，E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：
O多价1：A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群）；
O多价2：13，16，17，18，21群；
O多价3：28，30，35，38，39群；
O多价4：40，41，42，43群；
O多价5：44，45，47，48群；
O多价6：50，51，52，53群；
O多价7：55，56，57，58群；
O多价8：59，60，61，62群；
O多价9：63，65，66，67群。
3.H抗原的鉴定
属于A～F各O群的常见菌型，依次用所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第一相和第二相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：
H多价1：a，b，c，d，i；
H多价2：eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gq，mt，gz51；
H多价3：k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40；
H多价4：1，2；1，5；1，6；1，7；z6；
H多价5：z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38；
H多价6：z39，z41，z42，z44；
H多价7：z52，z53，z54，z55；
H多价8：z56，z57，z60，z61，z62.
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
检出第一相H抗原而未检出第二相H抗原的或检出第二相H抗原而未检出第一相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1或2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。
4.Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林伤寒沙门氏菌。
实验结果与报告
综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。
思考题
（1）如何提高沙门氏菌的检出率？
（2）沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？为什么？
（3）沙门氏菌检验有哪5个基本步骤？
（4）食品中能否允许有个别沙门氏菌存在？为什么？
