伽利略担任比萨大学数学教授，虽然忙于教授数学，但是比起以前来，他对实验工作也丝毫没有放松。他经常利用空闲时间做各种实验。他说他的目的是要用实验来重新检验一下亚里士多德有关科学的学说。伽利略主张，发现真理的道路，不是背诵亚里士多德的著作，而是要通过学习“大自然这本宝书”，要通过实验来检验。
伽利略到比萨大学任教不久，就以大无畏的精神，向当时居统治地位的亚里士多德的物理学原理挑战。亚里士多德有一个论点：不同重量的物体从同一高处下落的速度是不同的，其下落速度与物体的重量成正比。物体重量越大，下落就越快。千百年来，人们从来没有对这个论点怀疑过。可对此，伽利略在脑海里却画了个大大的问号。善于动脑筋的伽利略联想到他的摆动实验，摆不也是从高处落下的重物吗？从自己所作的多次实验看，同长度的摆无论摆锤的重量如何，它从同一高度落到最低点所用的时间却都是相同的。在自己实验的基础上，伽利略认为可能又是亚里士多德弄错了。他想，要解开这个谜，还必须通过实验来证明。
于是伽利略找来各种材料的物体来进行落体实验。伽利略首先站到桌子上，将两个不同重量的物体高举过头，然后同时放开，使重物同时自由落下，结果是距离相等，所用的时间也相等，二者同时落到地面。不过由于坠落距离太短，所用的时间也极短，所以沙钟很难将时间测准，比较起来也不够明显。他想，我需要在高处进行实验，让重物经过距离长一些，才好进行比较。而且需要有人帮助他来做这个实验。于是伽利略找来几个志同道合的学生，从各种高度进行落体实验，多次实验的结果表明：不管物体的重量大小，只要距离相等，其下落所用的时间也相等。为了进一步证实这一论点，伽利略对助手们说：“假如我们到比萨最高的地方去做这个实验，是不是也会得出相同的结果呢？”大家一致赞同。于是他们爬到全城最高的比萨斜塔上去做了这个实验，所得的结论与先前实验的结论是一样的。至此，伽利略十分自信地断定，亚里士多德的论点是不正确的。他还根据实验结果提出自由落体运动的规律。即不同重量的物体从同一高处下落，只要所受空气阻力、风力等相同，那么速度是相同的，会同时落地。
伽利略向教授们指出了亚里士多德关于自由落体运动的论点是不正确的，并提出他的主张。可教授们并不接受他的观点，他们坚持认为亚里士多德肯定是不会错的，倒是伽利略这个初出茅庐的狂妄之徒，不知天高地厚。竟敢说亚里士多德错了，简直是在胡说八道。一位物理教授还怒不可遏地讥讽道：“除了傻瓜外，没有人会相信一片羽毛同一颗炮弹能以同速度通过空间下降。”他声言要揭穿伽利略的荒唐，向伽利略提出挑战，企图使伽利略在众人面前当场出丑。
伽利略愉快地接受了这个挑战，并为这次“表演”而选定了比萨斜塔。
伽利略在校园里贴出了海报：邀请所有对落体运动感兴趣的人到比萨斜塔下去观看现场表演。
指定的日期到了，果然有许多人聚集在比萨斜塔下面。教授们穿着他们的紫色丝绒长袍站在斜塔前。许多学生和市民们则站在他们的后面。大家吵吵嚷嚷，议论纷纷。
伽利略走到前面，首先向现场观众说明了他和亚里士多德关于落体运动所持的不同观点。他举起两个大小不同的铁球，高声说：“请看，这两个球的重量，一个是4.5千克，另一个是0.45千克，按照亚里士多德的观点，它们落下来的速度，重球应该是轻球的10倍。可是我认为，它们下降的速度应该是相等的。若从塔顶把它们同时投下来，两个铁球会同时着地。”这时人群中有人在嘘他，不时爆发出一阵阵嘲弄的哄笑声。伽利略毫不在意，继续说：“你们马上就会看到，我同亚里士多德，究竟是谁说的对！”
伽利略讲完话，把两个铁球装在一个精致的匣子里。这个匣子是伽利略专门为这次实验精心制造的。只要按动一下匣子上面的按钮，匣子的底板即可自动打开，同时放出其中的两个铁球使之同时下落。伽利略把两个铁球装进匣子后，把匣子交给他的学生，他的学生带着这个匣子一步一步爬上斜塔顶层。
预定的时间到了，激动人心的时刻来到了，斜塔前鸦雀无声。人们的目光不约而同地向塔顶望去，只见塔顶那名学生轻轻按动一下匣子上的按钮，两个铁球同时下落，刹那间，似两道平行的闪电，在众目睽睽之下，同时触地。
当人们亲眼目睹重0.45千克和重4.5千克的铁球同时砰然落地时，都有些不敢相信自己的眼睛了。尤其是那些对亚里士多德的理论深信不疑的教授们，更是被实验结果惊得目瞪口呆，嘴里喃喃地说：“不可能！不可能！怎么会是这样呢！”是啊，被人们盲目崇拜一千多年的信条，在几秒钟内竟像肥皂泡一样幻灭了。
伽利略原以为，实验的成功一定会引起人们对他的祝贺和欢呼。可是他想错了，当他控制着自己的兴奋转过身去看那些观众时，却惊异地发现他们只是呆呆地站在那里，没有一点儿惊喜的表情。伽利略不觉有些茫然了。在那思想极端僵化的年代中，有谁能相信这个敢于蔑视“圣人”的青年人会推翻人们已经信奉了一千多年的权威理论呢？即使有少数赞同者，也都敬而远之，不敢公开表示祝贺。因为他们不愿意被人看做是这个“叛逆者”的同伙。
在铁的事实面前，那些亚里士多德的忠实信徒们，不得不在众人面前承认伽利略的观点是正确的。
斜塔上的实验成功了。斜塔上的挑战也以伽利略的胜利宣告成功了。它向世人宣告，真理是来源于实践的。它动摇了千百年来人们深信不疑的权威理论，产生了极其重要而深远的影响。这次著名的实验在比萨大学、比萨城引起了巨大轰动，成了当天比萨城的头号新闻，并且很快传播开去，乃至震动整个欧洲。后人曾将此事编成动人的故事，传为千古佳话。
伽利略在实验中虽然赢得了胜利，但却得罪了“圣人”、“权威”及一些因循守旧的教授，触犯了宗教神学。因为亚里士多德的观念早已成为天主教思想体系的一部分，因此随之而来的是报复、非难与惩罚。学校克扣他的薪金，缩短他的聘期。他的对头则教唆一部分学生在伽利略讲课时喝倒彩、起哄，甚至设法寻找某种借口，企图把伽利略从比萨大学赶出去，以解心头之恨。
伽利略在比萨这段时期，大公爵时常邀请教授们到宫廷参加宴会，以此来炫耀他周围有一批文人。伽利略由于科学发明和实验而小有名气，当然也常在邀请之列。在一次宴会上，他见到了科西莫大公爵的私生子若奥瓦尼。这位公子自称发明了一种挖泥机，准备用于疏浚里窝诺港口。一天，他拿着这个机器的模型，征求伽利略的意见，希望得到伽利略的赞颂。伽利略仔细琢磨后，直率地告诉他机器设计不合理，几乎根本不能使用。伽利略不客气的指点，使这位贵公子大为不悦，也严重挫伤了他的自尊心。因此他对伽利略也怀恨在心，伺机报复。伽利略自知得罪了杜斯干宫廷，预感到校方不会再继续聘用他了。
果然，不久伽利略不再被邀请参加宫廷宴会了。凡是没有受到宫廷邀请的人，大学当局便明白此人业已失宠，而须将他辞退。于是学校当局以他不配担任教育下一代青年人的职务为理由，撤掉伽利略的职务，把他赶出了比萨大学的校门。
