1591年，被比萨大学解除教授职务的伽利略，在比萨城无法立足，不得不沮丧地离开比萨，再次回到佛罗伦萨的家中。
伽利略被比萨大学逐出之前，他的父亲万桑佐因病去世了。在他父亲生命垂危之际，伽利略曾回家探望。万桑佐临死前，望着伽利略，握住他的手吃力地说：“孩子，以后这个家就靠你了。”伽利略深深地点了点头，还没有来得及回答，父亲就安详地闭上了双眼，再也没有睁开。从此，作为长子的伽利略，背上了沉重的家庭负担。这是一个多么艰巨的重担啊！他的大妹妹维金妮娅即将出嫁，需要一份丰厚的嫁妆。未婚夫要求嫁妆齐备后才能完婚。二妹妹莉维亚也到了该出嫁的年龄，同样需要一份嫁妆。二弟米舍朗吉罗此时正在学习音乐课程，需要一笔相当数量的学费。全家7口人的生活开销也不小。此外家里还有一笔债需要偿还。伽利略意识到了自己的处境和责任。
从父亲病逝到他离开比萨大学的这段时间里，伽利略还没有体会到沉重的家庭负担所带来的烦恼。可是失业回到家后，才真正体会到烦恼和忧愁的滋味。好不容易凑足了大妹妹的嫁妆，又为弟弟借了一大笔钱作学费。这时已是债台高筑。还有许多事情等着钱用呢！靠借债来维持家庭生活总不是长久之计。伽利略想：必须尽快找到一份收入丰厚的工作才行。
经过一番访察之后，伽利略了解到威尼斯的帕多瓦大学需要一位教数学和天文学的教授。可是这个大学是否会聘请他这个“声名狼藉”、被比萨大学解聘的青年教师呢？他写信给老朋友吉杜巴多侯爵，希望他给予帮助。很快他收到回信，侯爵在信中说：他很愿意帮忙，因为他器重伽利略的智慧和才干。他还让伽利略直接向帕多瓦大学提出申请，并邀请伽利略到他的封地佩萨奥去商讨办法。看了信，伽利略深受鼓舞，对于吉杜巴多的邀请感到格外高兴，决定立即前往。于是，伽利略卖掉父亲遗留下来的店铺，用一部分钱作旅费，其余都作家用。然后踏上前往佩萨奥的旅程。
吉杜巴多侯爵是一位德高望重的科学家。他热情接待了伽利略这位贫困潦倒的后生，并以上宾之礼隆重款待。他们变得十分投机。通过交谈，吉杜巴多更加了解这个青年人的才华和抱负，表示尽力帮助伽利略。他们一起商讨了谋取帕多瓦大学教授职位的方法。伽利略必须先行拜会几位有权势的人物，使他们相信他的才能。然后请他们向校方推荐。侯爵有许多朋友在威尼斯和帕多瓦大学，他分别给那些可能会对伽利略有帮助的人写了信，请他们予以关照。伽利略对侯爵大人的无私帮助感激之至，深表钦佩和谢意。侯爵坦然地对他说：“我这样做并不是为了你，而是为了科学。但是我已经老了，而你才28岁。这些年来，你所做的工作表明你的可塑性很强。知道如果为你创造更好的机会，你会取得更多的成就。”听了这一番感人肺腑的话，伽利略双眼潮湿了，他暗下决心，一定要在科学上取得更大成就，不辜负老人的知遇之恩。他把吉杜巴多的这一番话深深铭刻在心里，一生都没有忘记。
1592年，28岁的伽利略，在吉杜巴多侯爵等人的帮助下，正式被聘任为帕多瓦大学的数学和天文学教授。这使伽利略无比兴奋，因为对于他来说，没有比帕多瓦大学更理想的地方了。薪水极为可观，年薪约200元，是他在比萨大学任教时的3倍多。更重要的是，当时的帕多瓦大学素以鼓励科学探索和自由思想而驰名欧洲大陆，被人们誉为“学者的天堂”。许多著名科学家都曾在该校任教。如近代解剖学奠基人维萨留斯、静脉瓣的发现者法布里休斯、哲学家扎巴瑞拉等。在数学方面，帕多瓦大学的实力在当时意大利诸大学中也是名列前茅的。帕多瓦大学环境优美，距威尼斯32千米。它的自由之风也得益于素有“亚德里亚海的珍珠”之称的著名水城威尼斯。这座城市具有优越的地理环境，因而成为当时欧洲的贸易和文化中心。尤其那时的威尼斯政府在政治与宗教方面表现出少有的开明与宽容。大学校园的学术自由也受到政府法律的保护。帕多瓦大学隶属威尼斯城，由威尼斯城的议会选出的三位董事管理学校。他们维护着学校的自由气氛，拒绝罗马天主教会对他们政治和宗教生活的干涉。大学当局也欢迎具有各种信仰的教授学者前来讲学，且不过分规定教学内容。对伽利略来说，在这里大可不必担心由于批判亚里士多德的不正确的学术观点而遭到讥讽和迫害了，可以放心地、大胆地进行他的科学研究和实验。这正是他多少年来梦寐以求的环境。
伽利略是幸运的，帕多瓦大学向他敞开了大门。帕多瓦大学教授的讲坛在等待他的到来。这预示着他的事业将上升到一个新的高度。成功在向他微笑。
1592年12月7日，伽利略在帕多瓦大学校长和几位教授陪伴下，去上第一课。此时的伽利略表现出从未有过的自信和坦然。在这以前，伽利略认真总结了在比萨大学任教三年中，自己的工作方法和接人待物方面的不妥之处，悟出其中的道理，下决心吸取经验教训，弃旧图新，在新的岗位上搞好工作，尽力取得大家的尊重。
伽利略信步走上讲坛，教室里座无虚席。他用拉丁语讲的第一次课是“几何学”。的确，帕多瓦大学的伽利略与以前比萨大学的伽利略相比，几乎判若两人。在比萨大学时他故意装出一副自负的神态，以掩饰他不稳定的心情。在帕多瓦大学他既充满自信，又克制了在比萨大学时的“傲慢”习气。在教学上他注意启发学生的兴趣，不时地引用自己在物理学方面的实验作为数学例题，严密而又生动。伽利略讲得起劲时，完全陶醉在几何学的奇妙之中。当他眉飞色舞，滔滔不绝地讲完第一课时，听得入迷的学生们对他的精彩演讲报以热烈的掌声。他的讲课一开始就获得了极大的成功。
伽利略丰富的知识和出色的演讲，吸引了帕多瓦大学的学生们，听课的人越来越多，小教室已容纳不下，只好调到一个大教室，后来又换了一个更大的教室。即使这样，还是无法容纳有增无减的听课学生。
随着伽利略的声誉日渐提高，帕多瓦大学的许多学生，尤其是那些外国的留学生们都十分仰慕他的才学，希望请他作为辅导老师，并以成为伽利略的学生而自豪，以能够向伽利略请教为荣耀。为了满足这些学生的求知欲望，当然也为了增加一些收入，伽利略租了一幢宽敞的房子，开设了一个“寄住宿舍”，招收一些学生，其中有意大利的，也有一些其他国家的留学生。伽利略为他们讲课、辅导，有时还和学生们同吃同住，利用就餐和工作闲暇，随时同他们讨论各种问题。伽利略在学校里讲授的是数学和天文学，而在寄住宿舍里辅导的主要是物理学的理论和实验。有时还和学生们一起做实验。他们取得了许多实验成果。有些成果伽利略还没有来得及汇编成书，就已由他的学生传播到欧洲各国去了。
伽利略的学生中，有许多来自国外的贵族子弟。因为当时各国之间战争频繁，这些贵族子弟的兴趣主要在军事工程上，于是伽利略又适时开始研究军事工程学。虽然他对这门课程并不熟悉，但凭着他在数学、物理学方面的基础，很快进人了角色。他将数学知识、力学实验同军事工程有机地联系起来，开设了数学计算力量，特别是武器射击力量，以及建设防御工事等方面的课程。在课堂上他生动地向学生讲授：怎样计算炮弹的轨迹，如何调整大炮的角度，如何布防等。从此，伽利略又以精通军事工程享有盛名了。各公国的王子也都争先恐后进入他的寄住宿舍，向他学习这门学问。
多才多艺的伽利略，生活也是丰富多彩的。忙里偷闲，他有时光顾一些娱乐场所，参加舞会、宴会、音乐会、诗歌朗诵会、嘉年华会、滑稽戏等活动。在音乐会上，他经常既是听众，又是演奏者。他弹得一手好琵琶。他甚至还创作了几出滑稽戏，而且亲自扮演过某些角色，表演惟妙惟肖，逗得大家捧腹大笑。这时的伽利略真是开心极了。
1597年，一直未婚的伽利略在威尼斯的一次舞会上，与一位名叫玛丽娜·甘芭的女子相识。玛丽娜的美貌与开朗的性格深深地吸引了他。同时，玛丽娜对伽利略的才学和声望也十分倾慕。他们很快坠入情网。伽利略感到与玛丽娜一起生活很幸福，他们很快就同居了。但是，伽利略不想正式结婚，也许是因为他觉得没有信心既做科学家又做好丈夫。伽利略在他开办的寄住宿舍附近为玛丽娜购置了一幢住房，将她安置在那里，工作闲暇时，就去她那里。他们一起度过了许多美好时光。后来，玛丽娜生了二女一子。可惜，10年后他们终因志趣不同而分手了。
工作、生活在帕多瓦大学，伽利略几乎百事顺遂。但也有时为难以应付的经济负担而烦恼。虽然他的薪水已不薄，他的课外辅导的收入也不少，可仍旧负债累累。因为佛罗伦萨一家人的生活需要他负担，购买实验用品和仪器也需要一大笔钱。这沉重的经济负担压在他身上着实不轻。尤其是他的家人和家乡的亲戚们，听说他在帕多瓦大学十分得意，都把他看成摇钱树，对他的勒索无休无止。他的弟弟想去波兰一家贵族门下工作，一定要伽利略为他准备去波兰的旅费和见面礼。这笔钱的数目比伽利略的年薪还要大，但伽利略还是借到了这笔钱给他的弟弟。接着，他的妹妹爱上了一个不名一文的青年无赖，非要伽利略为她办嫁妆不可。伽利略借到她提出这笔钱的三分之一数额，并答应过一些时候再把其余部分给她。可是妹妹刚结婚，妹夫就在法庭告了他一状，要求付清未付部分，他的家族对他的要求依然接踵而至。伽利略对这些要求也还是有求必应，以致不得不四处借债。纵然他的收入不断地增加，可他的债台却愈筑愈高。有一次，他不得不向大学财务处请求预支两年的薪金。许多朋友向他伸出援助之手，尤其是他的那些贵族朋友们。可是，伽利略向来不肯轻易花别人的钱。多次婉言谢绝朋友们的无私资助。
后来，伽利略发明了一种很有实用价值的小仪器，名为“比例规”。仪器小巧玲珑，方便适用，尤其是在军事上，可用来解决许多武器实战中的数学问题。许多人对这台仪器很欣赏，表示愿意出高价购买。于是伽利略雇用工匠在他的指导下制造了许多。为了方便用户使用伽利略的比例规，他还编写了仪器使用说明书，因而比例规十分畅销。这样伽利略也从中获得极为可观的收入，不仅可以还清债务，还有盈余，从而摆脱了困境，不必再为沉重的经济负担而烦恼了，他可以全身心地投入到他的研究工作中去。
伽利略在帕多瓦大学结交了许多朋友，其中不乏一些医生朋友。一天，他的医生朋友说：“人生病时，他的血液温度通常会升高，可惜现在我们还无法测定它。”伽利略听了，心里想：如果发明一种能测定人体温度的仪器，那会对医生诊病有很大帮助的。为此伽利略通过实验研究，根据热胀冷缩原理，又发明了空气温度计。这种仪器的结构很简单，是一根玻璃管、一端开口，另一端有一小泡。然后将玻璃管注满带色的水，将其开口的一端立于水盆内的水而之下。这样在小泡内出现一个含有空气的空间。从而构成一个随空气温度变化而引起空间变化的小仪器。如果在小泡上稍微加热，便会使小泡内的空气受热而膨胀。受热愈大，其膨胀也愈大，占据的空间也越大，排出的水也越多。当热量散失后，泡内的空气因变冷而收缩，水又进入管子。因此根据管上刻度测出管中水的高度变化，可以方便地测定空气温度的变化，也可以用于测定病人体温。尽管它还很粗糙，也不够精确，却为后来的水银温度计的发明提供了启示。
伽利略在帕多瓦度过的18年，是他一生中最幸福的时光。也是他从事科学活动的黄金时期。这一阶段他在力学研究方面取得了辉煌成果，建立了自由落体运动定律，发现了惯性定律和抛射体运动规律，并确定伽利略相对性原理，创立了科学的实验方法，从而为动力学研究奠定了基础。也是在这一阶段，伽利略用自制的望远镜，发现了许多新天象，绘制出第一幅月面图，发现了木星的四个卫星及金星的位相，在天文学方面取得许多重大突破。伽利略一生中的大部分成果是在帕多瓦完成的。在他离开帕多瓦以后的岁月里，尤其是在他失意的时候，他始终深深地怀念着在帕多瓦度过的美好时光。
