实验目的
（1）掌握PCR反应的基本原理和实验技术。
（2）学习扩增乳酸菌基因组上特定的基因。
实验原理
聚合式酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由三步反应组成一个循环：高温变性模板、引物与模板退火和引物沿模板延伸。通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3′端开始掺入，以目的基因为模板从5′→3′方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易使目的基因在只有皮克（10-12g）级的DNA混合物中扩增到纳克、微克、毫克级。因此，PCR技术一经问世就迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊治、肿瘤机制的探索、法医鉴定等诸多方面。PCR的原理。
实验材料
（一）模板和引物
以乳酸菌基因组DNA为模板，正向引物F1和反向引物R1分别对应于乳酸菌16SrRNA基因两侧的保守序列，能够扩增出该基因1500bp左右的片段。
正向引物F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
反向引物R1：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。
（二）试剂
脱氧核苷酸（dNTP）、Taq酶、正向引物F1、反向引物R1、PCRmarker、10×PCR反应缓冲液。
（三）仪器及其他用品
PCR仪、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪。
实验流程
PCR反应体系的添加→PCR反应→电泳检测实验结果
实验步骤
（一）PCR反应体系的添加
在冰浴中，按顺序将各成分加入到无菌的0.5mL的PCR管中。
（二）PCR反应程序
将PCR管放入PCR仪中，按照以下的反应程序，进行扩增。
（三）电泳检测实验结果
取5μL PCR反应产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，参照marker估计反应产物的相对分子质量大小。
实验结果与报告
利用紫外凝胶成像系统观察PCR反应产物的纯度、浓度以及相对分子质量大小，并作记录。
注意事项
（1）所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中应该戴手套。
（2）PCR试剂的配制应该使用灭菌的超纯水。
（3）试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装储存。
（4）PCR的样品应该在冰浴上化开，并且要充分混匀。
（5）在配置PCR反应体系的过程中，Taq酶应在加入dNTP混合物后再加入，因为有些酶的3’→5’外切酶的活性较强，反应体系中如果不含dNTP，反应体系中的引物可能被分解。
（6）非特异性扩增产物可能是由于模板有与引物同源性高的其他位点。其次是复性温度太低，适当提高复性温度即可解决。引物浓度太低时，有时也会导致扩增产物太少；而引物浓度太高，比较容易出现非特异性的扩增反应。
（7）无扩增产物的现象可能是由于DNA酶污染，造成模板和引物降解而导致的。引物3’端和5’端书写错误，合成错误的引物，不能正常扩增，解决这样的问题只有重新合成引物。
思考题
（1）PCR反应的原理是什么？
（2）你在实验中得到了何种结果，结合得到的结果分析PCR扩增应该注意哪些问题？
