实验目的
掌握用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA纯度和浓度的方法。
实验原理
DNA带负电荷，在电场作用下可以向阳极移动，相对分子质量越小，迁移越快，相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构象对迁移速度也有一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线状，线状大于开环。在一定的电压范围，线状DNA片段的迁移速率与所加的电压成正比。因此，借助于电场中的缓冲体系，依据DNA样品性质不同可进行分离。
溴化乙啶（EB）在紫外线照射下能发射荧光，当DNA与EB结合时，使发射的荧光增强，而荧光的强度与DNA的含量成正比，根据荧光的强弱可以判断待测DNA含量的多少。
为了使分辨效果更好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm。因此，我们可以利用这些特性通过琼脂糖凝胶电泳，区别不同相对分子质量的DNA片段和质粒。
实验材料
（一）基因组DNA
实验37中提取的乳酸菌基因组DNA。
（二）试剂
（1）琼脂糖。
（2）溴化乙啶（即EB）储存浓度10mg/mL、使用浓度0.5μg/mL。
（3）50×TAE缓冲液Tris□HCl 242g，冰乙酸57.1mL，EDTA（0.5mol/L，pH8.0）100mL，定容至1000mL。
（4）1×TAE缓冲液 将母液稀释50倍。
（5）6×点样缓冲液0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、400g/L蔗糖水溶液。
（三）仪器及其他用品
电泳仪、电泳槽、微波炉、紫外检测仪、一次性手套、微量移液器。
实验流程
制胶→点样→电泳→紫外灯下观察
实验步骤
（一）制胶
（1）选择合适的水平式电泳槽、稳压电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。
（2）选择孔径大小、厚薄适宜的点样梳，放于水平电泳槽的制胶板上，制胶板两端用熔化的胶封严。
（3）配制1%的琼脂糖凝胶15mL。称取0.15g琼脂糖，放入三角瓶中，加入15mL1×TAE缓冲液，放入微波炉中加热。等琼脂糖熔化后取出，冷至60℃后加EB一滴（最终浓度大约为0.5μg/mL），摇匀，轻轻倒入凝胶托盘中，除掉气泡，加入点样梳。
（4）凝胶凝固后，小心取出两端挡板和梳子，将载有凝胶的电泳胶板放到电泳槽的平台上，加入1×TAE缓冲液，使其刚好浸没胶面（液面约高出胶面1mm）。
根据实验需要，溴化乙啶也可不直接加入胶中，而是在电泳完毕后，将凝胶放在含有0.5mg/mL的EB中染色15～30min，然后转入蒸馏水中脱色15～30min。
（二）点样
将1μL点样缓冲液和5μL的样品混合均匀后点在点样孔中。如果需要的话，可在其余一个点样孔中点入适合DNA片段大小的marker。
（三）电泳
接通电源，采用1～5V/cm的电压，电泳到溴酚蓝和二甲苯青FF在凝胶的中段时停止电泳，关闭电泳仪，取出电泳凝胶托盘。
（四）紫外观察凝胶
将凝胶托盘置于紫外分析仪或者紫外凝胶成像系统下观察实验结果并记录。如果点入marker的话，可根据marker和DNA片段的位置来判断DNA的大小。
注意事项
（1）取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶凝固。
（2）点样要细心，以免点样枪头刺破凝胶或者将样品点出。
（3）电泳时，电极一定要连接正确。
（4）染色剂溴化乙啶是强诱变剂，有毒性，与该溶液接触时必须戴一次性手套，使用后的废液不可随意丢弃。
思考题
（1）溴化乙啶染色的原理是什么？
（2）电泳时DNA在电场中应该往哪极移动？
