实验目的
（1）掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
（2）观察双歧杆菌的形态特征并了解双歧杆菌的生长特性。
（3）了解双歧杆菌鉴定的一般方法。
实验原理
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37～41℃，最低生长温度25～28℃，最高43～45℃。初始最适pH6.5～7.0，在pH4.5～5.0或pH8.0～8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌、该菌可以在肠黏膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌、痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
为使双歧杆菌顺利地分离和良好地生长，必须掌握对这类菌的分离培养厌氧技术，创造适于双歧杆菌生长发育的条件。双歧杆菌的培养方法很多，主要有亨盖特氏滚管技术、厌氧罐、厌氧袋和厌氧箱等。
在双歧杆菌固体培养基中添加X-α-半乳糖可同时计数双歧杆菌和其他乳酸菌。由于样品中的双歧杆菌的α-半乳糖苷酶的活性比其他乳酸菌高，以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-半乳糖（X-α-gal）作为底物，则α-半乳糖苷酶可分解底物释放出吲哚，在平板上呈现蓝色。由于双歧杆菌释放的吲哚数量多于其他乳酸菌，故双歧杆菌的菌落呈蓝色，而其他乳酸菌的菌落为淡蓝色或白色。
实验材料
（一）样品
含双歧杆菌的发酵乳（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
（二）培养基
TPY培养基（培养基13）（培养）、BS培养基（培养基6）（鉴定）。
（三）仪器及其他用品
高纯氮气、厌氧管、注射器、培养箱、水浴锅、玻璃涂布棒、记号笔、酒精棉球、瓷盘、振荡器、定量加样器、恒温水浴、载玻片、显微镜、厌氧培养箱、厌氧罐等。
实验流程
样品→稀释用液制备→稀释样品→涂布平板→厌氧培养→计数
实验步骤
（一）样品的收集和制备
1.取样要点
（1）取样时要避免样品暴露于空气，尽可能快地带回实验室，不要冷冻。
（2）取样后尽快接入合适的培养基中，置于适宜的无氧条件下培养。
（3）不要使用富集培养基或转移培养基。可用稀释液或直接取少许样品划线培养。
2.取样和样品的转移
（1）无氧试管或小瓶法 用带丁烯橡胶塞的螺口胶盖试管或小瓶，或其他带盖的可密封的容器，其中含有无O2的N2或CO2，或混合气体（CO2、N2和H2），管内装有预还原稀释液可作样品稀释用，未装稀释液的试管和小瓶可作为小样品的携带容器。
（2）针筒法 液体样品可用无菌针筒抽取，立即排出多余的空气，随后将注射针尖插入无菌橡皮塞中，尽快在实验室分离培养。
（3）棉拭子法 采取临床标本时常用此法。对于双歧杆菌可用于采集人齿的双歧杆菌样品。操作时宜用双试管系统。带橡皮塞的试管中充有无O2的气体。一管内装灭菌的棉拭子，另一管装半固体琼脂培养基。用棉拭子采样后，即可直接插入装有培养基的试管，再进行分离培养。
（4）简易厌氧袋法 可用于棉拭子和其他样品的转移。样品放入灭菌的塑料管、针筒或松口的螺帽试管和玻璃瓶内，放置气袋内。袋内装有产气安瓿管和指示剂。取样后立即封闭上端，用夹子夹紧或扎一安全带。
（二）样品稀释液的制备
（1）制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2.此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂――刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
（2）在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用振荡器将其振荡均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一支装有9mL生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。
（三）分离
通常选10-4，10-5，10-63个稀释度进行培养计数，取0.1mL样品稀释液置于BS培养基琼脂平板上用玻璃涂布棒涂抹均匀，置于厌氧罐或厌氧培养箱中，37℃条件下厌氧培养48～72h。
（四）计数并镜检
1.计数
按在BS平板上生长的菌落数，选取30～300之间的平板计数，计算出1g和1mL样品中的菌数。公式如下：
双歧杆菌数[CFU/g（mL）]=平板菌落平均值×10×稀释倍数
2.镜检
挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。
（五）纯菌培养与保藏
纯化后的双歧杆菌可在TPY培养基中厌氧继代和扩大培养，各种厌氧培养方式，最后采用适合的保藏方式进行保藏，参见实验13.
实验结果与报告
（1）观察双歧杆菌形态，描述其形态特征。
（2）计算每1g或每1mL样品中含有的双歧杆菌数量，记录结果。
思考题
实验中通过哪些措施和方法保持细菌的厌氧状态？
§§第三章 乳酸菌遗传学实验技术
