实验目的
（1）掌握从发酵乳及开菲尔粒中分离纯化乳杆菌和乳酸球菌的方法。
（2）学习乳杆菌和乳酸球菌的初步鉴定方法。
实验原理
乳酸菌能利用可发酵性糖产生乳酸，人们利用其产酸特点发酵生产某些食品，提高食品适口性或延长储藏期。例如，利用乳酸菌发酵生产乳制品（如酸乳、干酪、牛乳酒等）、各种植物发酵制品（如泡菜和青储饲料等）。因此，从自然界中有目的地分离纯化鉴定某些乳酸菌，对于开发新产品、提高发酵食品质量具有实际应用价值。
从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的pH、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件、对样品进行特殊处理等。常用的纯种分离方法有平板划线分离法、简单平板分离法、稀释分离法、涂布分离法、毛细管分离法、显微操作单细胞分离法等。
发酵乳中乳酸菌的分离采用溴甲酚绿（BCG）牛乳营养琼脂平板分离法。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈蓝色。在分离培养基（pH6.8）中加入溴甲酚绿指示剂后呈蓝绿色，乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖，产生乳酸，使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。在含有CaCO3的培养基中，乳酸菌产生的乳酸能将培养基中的CaCO3溶解，菌落周围产生透明圈。但是出现CaCO3溶解圈仅能说明该菌产酸，不能证明就是乳酸菌，还要进行有机酸的测定，乳酸可用纸上层析法鉴别。此外，从开菲尔粒中分离纯化乳酸菌时，因其含有一定数量的酵母菌，为此在上述相应的分离培养基中还要加入山梨酸钾、脱氢醋酸钠或纳他霉素等防腐剂，以抑制真菌的生长。初步鉴定后的乳酸菌应进行生理生化试验以确定其菌属，还需结合16SrRNA序列分析等方法以精确鉴定到种。
实验材料
（一）分离样品
市售普通酸乳（要求有活性）、开菲尔粒滤液（要求新活化好的）。
（二）培养基
乳清琼脂培养基（培养基17）、溴甲酚绿（BCG）牛乳琼脂培养基（培养基20）、番茄汁琼脂培养基（培养基7）、酸化MRS琼脂培养基（培养基10）、改良MRS琼脂培养基（培养基9）、MRS液体培养基（培养基14）（5mL或10mL/试管）、脱脂乳培养基（培养基18）（5mL或10ml/试管，200mL/三角瓶，0.07MPa灭菌20min）。
（三）试剂与染色剂
无菌生理盐水（9mL/试管，45mL/100mL三角瓶，内带玻璃珠）、灭菌吐温-80（10倍稀释液）、CaCO3粉末（用硫酸纸包好，高压灭菌）、3%的H2O2溶液、乳酸标准样品、革兰氏染色液。
（四）仪器与其他用品
无菌吸管（1mL、5mL）、无菌培养皿、接种环、特制蜗卷铂耳环、玻璃涂布棒、酒精灯、培养箱、显微镜、振荡器等。
实验流程
分离纯化乳杆菌和乳酸球菌的方法如下：
待分离样品→梯度稀释→平板分离培养→观察菌落特征→挑单菌落→纯化培养→镜检个体形态、纯度→H2O2酶试验→传代培养→挑选凝乳管→乳酸测定→菌种保存
乳酸菌的分离鉴定流程。
实验步骤
（一）用酸化MRS培养基分离酸乳中的乳杆菌
1.样品稀释
用无菌吸管吸取待分离样品5mL，移入盛有45mL无菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中，充分振摇混匀，即为10-1的样品稀释液。另取一支吸管自10-1三角瓶内吸取1mL移入10-2无菌生理盐水试管内，反复吹吸混匀，再按10倍梯度稀释至10-6、10-7稀释度。
2.平板分离培养
取上述10-6、10-7稀释度的稀释液各1mL分别注入无菌培养皿中，每个稀释度做两个重复。以无菌操作按20～30g/L的量将灭菌的CaCO3加入熔化了的酸化MRS琼脂培养基中，于自来水中迅速冷却培养基至50℃左右（稍烫手，但能长时间握住），边冷却边摇晃将瓶内CaCO3摇匀（勿产生气泡）的同时，立刻倒入培养皿内摇匀（CaCO3不能沉淀于平皿底部），使样品稀释液和CaCO3均匀分布于培养基中。待培养基凝固后，倒置于30℃（酸泡菜汁样品）和40℃（酸乳样品）温箱中培养24～48h。
3.观察菌落特征
酸乳中的德氏乳杆菌保加利亚亚种：菌落周围产生CaCO3的溶解圈，菌落直径1～3mm，边缘不规则，呈白色至灰白色，菌落表面较粗糙。
4.纯化培养
挑取典型单菌落5～6个分别接种于MRS液体培养基试管中，40℃温箱中培养24h。
5.镜检形态
取上述试管液体培养物1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察个体形态和纯度。酸乳中的德氏乳杆菌保加利亚亚种为G+菌，细胞宽约2μm，呈长短不等的杆状，单生、成对或长丝状排列。同时挑取1环培养液与载玻片上的3%H2O2混匀，观察产气泡情况。
6.乳酸测定
取上述试管培养上清液采用纸层析法检测乳酸的产生情况。
（二）用乳清培养基和BCG牛乳培养基分离酸乳中的乳杆菌和乳酸球菌
1.样品稀释
方法同上。
2.平板分离培养
取其中10-6、10-7稀释度的稀释液各0.1～0.2mL，分别接入BCG牛乳琼脂平板和乳清琼脂平板中，用无菌玻璃涂布棒依次涂布，每个稀释度做两个重复，或直接用接种环蘸取原液或10-1的样品稀释液1环做平板划线分离，倒置于40～43℃温箱中培养48h。
3.观察菌落特征
如出现圆形或不规则状、隆起或稍扁平、表面光滑或较粗糙的黄色菌落，及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌。
4.纯化培养
将典型单菌落5～6个分别接种于脱脂乳试管中，置40～43℃温箱中培养8～24h至牛乳凝固，无气泡，呈酸性。
5.镜检形态
取上述试管凝固培养物1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察细胞呈杆状或链球状，革兰氏染色阳性，同时挑取1环培养液与载玻片上的3%H2O2混匀，不产气泡。则将乳凝固的培养物转接入5mL灭菌脱脂乳试管中连续传代若干次，挑选出于40～43℃培养3～4h，或37℃培养8～12h能凝乳的试管，保存备用。
6.乳酸测定
乳酸的鉴定及生成量的测定：其发酵上清液经纸层析测定证明产乳酸。
（三）用M17和改良MRS培养基分离开菲尔滤液中的乳酸球菌和乳杆菌
1.开菲尔粒的活化
将用无菌水清洗过的开菲尔粒按5%的比例接种至灭菌脱脂乳中，于25～28℃培养16～20h至牛乳凝固。如此连续活化几代直至开菲尔滤液的pH达3.7左右，备用。
2.样品稀释
用无菌吸管吸取开菲尔粒滤液5mL移入盛有45mL无菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中，再滴入几滴稀释10倍的吐温-80（有分散菌体作用），置振荡器中充分振荡30min，即为10-1样品稀释液。另取一支吸管自10-1三角瓶内吸取1mL移入10-2无菌生理盐水试管内，反复吹吸混匀，以充分散开菌体细胞。重复以上操作，制备10-6、10-7样品稀释菌液。
3.平板分离培养
取上述10-6、10-7稀释度的稀释液各1mL注入相应的无菌培养皿中，分别倒入熔化并冷却至50℃左右的番茄汁琼脂培养基和改良MRS培养基，其用量恰好覆盖平皿底部一薄层，迅速与稀释菌液混匀，待凝固。或直接用接种环蘸取10-1的样品稀释液1环做平板划线分离。将培养皿倒置于37℃温箱中（分离乳杆菌最好倒置于含有5%CO2+95%空气的二氧化碳培养箱中）培养36～48h后，观察菌落特征。
4.观察菌落特征
在M17平板上乳酸球菌的菌落大小为1～2mm，表面光滑、隆起、圆形、呈黄色，其周围的培养基也变为黄色。在改良MRS平板上乳杆菌的菌落大小为1～3mm，表面较粗糙如雪花状，边缘不规则、扁平、灰白色、半透明，菌落周围CaCO3的溶解圈。
5.纯化培养
挑取典型单菌落10个分别接种于相应的液体培养基试管中（应与分离培养基一致），置于37℃温箱中培养24h。
6.镜检形态
取试管液体培养物1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察个体形态和纯度。乳酸球菌为：G+菌，细胞呈球形或卵圆形，一般成对地链状排列；乳杆菌为G+菌，细胞形态为多样性，粗长杆、细长杆、弯曲杆、短杆和棒杆等，单在或呈长短不一的链杆状排列。同时取1环培养物与载玻片上的3%H2O2混匀，不产气泡。则将液体培养物转接入5mL灭菌脱脂乳试管中连续传代若干次，37℃培养，观察其凝乳性状，挑选出8～12h能凝乳的试管，保存备用。
7.乳酸测定
乳酸的鉴定及生成量的测定：其发酵上清液经纸层析测定证明产乳酸。
8.发酵性能鉴定
将上述保存的脱脂乳试管培养物活化2～3代后。以1%～2%接种量移入盛200mL灭菌脱脂乳的三角瓶中，37℃培养至乳凝固；测定其酸度、活菌数、凝乳时间、还原刃天青的时间，同时进行感官品质评定，从中筛选出活力较高的菌种制备发酵剂。
9.生理生化试验
鉴定流程，具体方法参见实验11.
实验结果与报告
描述乳酸球菌和乳杆菌在不同培养基平板上的菌落特征，记录H2O2酶试验结果和镜检纯化培养物的纯度（菌种纯一），并绘制所分离的乳酸菌个体形态图。
思考题
（1）试设计一个从市售酸牛乳中分离纯化乳酸菌的程序。
（2）某乳品企业生产酸乳的菌种污染了酵母菌或芽孢杆菌，请设计简明实验方案解决。
（3）CaCO3加入熔化的MRS琼脂培养基后，为什么要立即用冷水冷却？
