一、富集培养生化鉴定法
实验目的
学习乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测和鉴定方法。
实验原理
李斯特氏菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源。李斯特氏菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特氏菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特氏菌共有7个菌株：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeri monocytogenes），绵羊李斯特氏菌（L。iuanuii），英诺克李斯特氏菌（L。innocua），威尔斯李斯特氏菌（L。innocua），西尔李斯特氏菌（L。seeligeri），格氏李斯特氏菌（L。grayi），默氏李斯特氏菌（L。murrayi）。其中单核细胞增生李斯特氏菌（简称单增李斯特氏菌）是惟一能引起人类疾病的人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，对乳、肉、蛋均有不同程度的污染，食品中存在的单增李斯特氏菌危害人类的安全，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。利用生理生化反应、毒力试验和协同溶血试验可以对该菌进行鉴定。目前国内外也出现了一些特征性的显色培养基可对单增李斯特氏菌进行检测的技术，如AES显色培养基、陆桥公司的李斯特氏菌显色培养基等。
实验材料
（一）样品和试验材料
待检测乳样，马红球菌，小白鼠（16～18g）。
（二）试剂
1%盐酸吖啶黄溶液，1%萘啶酮酸钠盐溶液。
（三）培养基
EB增菌液（培养基107），李氏增菌液（LB1，LB2）（培养基108），三糖铁（TSI）琼脂（培养基96），SIM动力培养基（培养基110），血琼脂（培养基100），改良的McBride（MMA）琼脂（培养基109），硝酸盐培养基（培养基53），葡萄糖蛋白胨水（培养基46），糖发酵培养基（培养基51），含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE），含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）（培养基106）。
（四）仪器及其他用品
培养箱（30℃，24℃）、冰箱、显微镜、离心机、离心管、无菌注射器、灭菌平皿、移液管、试管等。
实验流程
单增李斯特氏菌的检验流程。
实验步骤
（一）样品的收集及处理
无菌取样品25g（mL）置于灭菌均质器中加225mL EB和LB增菌液，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱中。
（二）增菌培养
EB增菌液225mL于（30±1）℃培养48h，LB1增菌液225mL于（30±1）℃培养24h，吸取0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。
（三）分离培养
将EB增菌液和LB2二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，于（30±1）℃培养24～48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色小的圆形菌落。
（四）动力性观察
选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂和（SIM）动力培养基，培养于（25±1）℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2～5d，阳性者可做下一步鉴定。
（五）纯培养
将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）上纯培养，做以下鉴定。
（六）染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为（0.4～0.5μm）×（0.5～2.0μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
（七）生化特性
将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别。
（八）对小鼠的毒力试验
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，30℃培养24h，离心，弃上清液，用0.85%灭菌生理盐水制备成浓度为1010CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3～5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。
（九）协同溶血试验（cAMP）
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌（R。equi），在它们两者之间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，30℃培养24～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌（L。seeligeri）的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌（L。ivanovii）在马红球菌附近的溶血增强。
实验结果与报告
详细记录实验步骤，根据各实验反应结果报告单核细胞增生李斯特氏菌阴性或阳性。
思考题
用富集培养法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌优缺点是什么？
二、PCR快速检测法
实验目的
学习用PCR方法检测乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌。
实验原理
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeri monocytogenes）简称单增李斯特氏菌，是一种严重引起食源性疾病的病原菌，在自然界中分布广泛，对乳、肉、蛋均有不同程度的污染。随着分子生物学技术的发展，目前可用PCR、DNA杂交等技术对各种病原菌进行检测。与传统方法相比，分子生物学的方法具有特异性强、灵敏、快速的特点。
PCR检测病原菌的原理是：将病原菌的特异性基因，如它的致病基因经PCR扩增后，再经过琼脂糖电泳和溴化乙啶染色，并在紫外灯下检测有无扩增带。
PCR的原理：人工设计出一对分别与所检测基因的5′端、3′端DNA序列互补的寡核苷酸作为引物，15～30bp长。在有引物、模板和Taq DNA聚合酶的反应体系中，95℃下DNA模板变性，在温度55℃下，引物与变性的模板复性配对，在72℃时，Taq酶按模板DNA合成出新的DNA链。经过多次的变性、复性和延伸这三个过程的循环，使特异的基因被扩增，DNA拷贝数量呈大量增加，通过琼脂糖电泳及溴化乙啶染色，可观察到扩增的DNA带。
美国杜邦公司根据PCR原理，开发研制出BAX病原菌检测系统，可快速对食品中的病原菌进行检测。在BAX系统中对单核细胞增生李斯特氏菌的检测，采用特定的引物，PCR扩增出400bp的DNA片断。若有这条扩增带，表明检测为阳性。反之，则为阴性。本实验采用BAX系统进行检测。
实验材料
（一）样品
待检测的乳制品样本。
（二）试剂
（1）引物、细胞裂解液（均购自美国杜邦公司）、PCR试剂盒（包括Taq聚合酶，10×Buffer，dNTP，超纯水）。
（2）TBE电泳缓冲液（5×TBE）Tris碱54g/L，硼酸27.5g/L，0.5mol/L EDTA，pH8.0，20mL/L。
（3）溴化乙啶（EB）溶液（10mg/L）100mL水中加入1mg溴化乙啶，完全溶解后保存于棕色瓶中。使用浓度为0.5μg/mL。
（4）溴酚蓝加样缓冲液（6×）0.25%溴酚蓝加到40%的蔗糖溶液中。
（三）培养基
（1）LEB增菌液 胰蛋白胨30g，酵母粉6g，无水KH2PO4 1.35g/L，无水NaHPO49.6g/L，盐酸吖啶黄15mg/L，萘啶酮酸40mg/mL，放线菌酮50mg/L，丙酮酸（钠盐，Sigma，10%水溶液）11.1mL/L。
（2）MOPS-BLEB后增菌液 即用MOPS代替LEB中的磷酸盐（KH2PO4和Na2HPO4），MOPS为3-（N-吗啉代）丙磺酸。
（四）仪器及其他用品
PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、电泳槽、匀浆器、离心管、PCR管、Tip头、一次性手套等。
实验流程
样品→打碎→前增菌→后增菌→PCR模板的制备→PCR→琼脂糖电泳检测
实验步骤（以BAX系统为例）
（一）PCR模板的制备
1.前增菌
将25g样品加入225mL EB增菌液，用匀浆器打碎后，于35℃下保温18～24h。
2.后增菌
将0.1mL前增菌液加入到10mL MOPS-BLEB的后增菌液中，于35℃保温24h。
3.制备PCR模板
在1mL细胞裂解液中加入12.5μL蛋白酶液，将上述细胞裂解液200μL加入到离心管中，然后再加入5μL样品后增菌液，于55℃保温60min；而后在95℃下处理10min，于冰上冷却5min后，转移至PCR管中进行PCR扩增。
（二）PCR扩增
将50℃制备好的样品裂解液加入到PCR管中，再加入引物、Taq DNA聚合酶（10×Buffer，dNTP，超纯水），进行PCR扩增。在PCR仪中初始的变性温度为94℃，2min；在以后的循环变性温度为94℃，15s，复性和延伸的温度为70℃，3min。共循环38次。
（三）琼脂糖电泳检测
配制2%的0.5×TBE琼脂糖凝胶；每个样品中加入15μL溴酚蓝即可加入到琼脂糖凝胶中，在180V下电泳30min；再用溴化乙啶染色，于凝胶成像仪中紫外灯下观察。
（四）实验结果
观察是否有阳性扩增带并根据DNA分子marker的大小，判断所扩增基因的相对分子质量。
注意事项
（1）李斯特氏菌是一种人畜共患的致病菌，可引起脑膜炎、败血症等，操作时请小心防护。
（2）溴化乙啶是致癌物质，必须戴手套操作。
实验结果与报告
详细记录实验步骤，并将电泳照片贴在实验结果处（或在实验结果处画出电泳的DNA条带的位置）。
思考题
（1）用PCR方法检测食品中李斯特氏菌的原理是什么？
（2）PCR方法可能出现假阳性的原因是什么？
