实验目的
学习和掌握用普通PCR方法检测婴儿乳粉中阪崎肠杆菌的原理和方法。
实验原理
阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是一种有周生鞭毛，能运动，无芽孢，兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，在1980年以前，阪崎肠杆菌称为产黄色素阴沟肠杆菌。目前食品中的阪崎肠杆菌问题已受到了全世界的普遍关注，许多实验室都在对该菌进行重点研究，以便建立科学的政策与控制措施。阪崎肠杆菌是乳粉中危害健康的生物因素之一，阪崎肠杆菌能引起新生儿脑膜炎。
阪崎肠杆菌可在生产至食用的整个过程中存活，容易造成生产过程中的污染并进而引起致病。阪崎肠杆菌能在很宽的温度范围内生长（6～47℃）。阪崎肠杆菌相对于其他的肠杆菌科迟滞时间和代时更短。因此冲调好的乳粉中如果含有少量的阪崎肠杆菌（1CFU/mL），在较短时间内就能增殖到107CFU/mL，从而威胁健康。
食用乳粉引起阪崎肠杆菌感染主要导致婴儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症。婴儿脑膜炎发病率为1/1000～1/4，而由阪崎肠杆菌引起脑膜炎（占总发病量＜4%）是新生儿常见的肠胃道疾病，肠杆菌科细菌引起坏死性小肠结肠炎占总发病量的29%，而由阪崎肠杆菌引起坏死性小肠结肠炎占总发病的比例随着近年阪崎肠杆菌分离技术的发展变得越来越大。
目前阪崎肠杆菌的检测方法分为三类，一类是传统的培养方法及其改进方法；一类是普通PCR方法；一类是实时荧光PCR方法。
传统的培养方法，以美国FDA推荐的从脱水的婴儿配方乳粉中分离和计数阪崎肠杆菌方法为代表，美国FDA（2002）推荐的方法需要5d时间，以最大可能数法（MPN）为基础，需要一共333g样品（3×100g，3×10g，3×1g），包括：前增菌、EE肉汤增菌、VRBG选择性培养基分离、API鉴定系统、产黄色素实验、氧化酶反应等步骤。采用的VRBG培养基选择性培养所有肠杆菌科的微生物。
在美国FDA方法的基础上，还有一些方法采用了改进的选择培养基分离、计数或通过荧光强度计数阪崎肠杆菌。根据阪崎肠杆菌菌株都具有α-葡萄糖苷酶活力的特点，在选择培养基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α，D-glucopyranoside，X-α-Glc）、4-甲―型-α-D-葡萄糖苷、邻硝基苯-α，D-葡萄糖苷等产色的葡萄糖苷酶底物，显色培养基上的阪崎肠杆菌呈蓝绿色菌落，从而提高了选择性培养基的选择性、缩短了检测时间。或者根据阪崎肠杆菌使葡萄糖苷酶底物产生的荧光强度，确定阪崎肠杆菌数量。
采用普通PCR方法对阪崎肠杆菌污染进行快速筛选，对于怀疑是阪崎肠杆菌阳性样品而采用传统培养方法进行分离、鉴定。乳粉经增菌后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否有特征条带，从而对乳粉中是否污染阪崎肠杆菌进行快速筛选。引物序列为5’-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3’；5’-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3’。扩增产物为282bp。
实验材料
（一）样品
待检测的婴儿乳粉。
（二）试剂
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。
1.培养基
改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（MLST）（培养基86），脑心浸液（BHI）（培养基89），营养肉汤（NB）（培养基104）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）（培养基83）、显色培养基琼脂（X-α-GlcA）（培养基99）。
2.引物
5’-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3’；5’-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3’。
3.反应体系
Taq DNA聚合酶、dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、琼脂糖、溴化乙啶。
4.阪崎肠杆菌质控菌株
ATCC29544.
5.相对分子质量标记
100bpDNAladder。
6.DNA提取试剂
细菌基因组DNA提取试剂盒。
7.TE缓冲液
10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA（pH8.0）。
8.10×PCR缓冲液
200mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2.
9.5×TBE电泳缓冲液
Tris54g、硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL，使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。
10.6×加样缓冲液
30mmol/L EDTA，36%（体积分数）甘油、0.5g/L二甲苯青FF、0.5g/L溴酚蓝。
（三）仪器及其他用品
天平、PCR仪、离心机、紫外凝胶成像仪、电泳仪、pH计、移液器、恒温培养箱和恒温水浴锅等。
实验流程
阪崎肠杆菌的检测流程。
实验步骤
（一）增菌
无菌称取乳粉试样100g，加到已预热的（44℃）装有900mL MLST的2L三角瓶中，振摇使样品充分混匀后，44℃恒温培养22～24h。在液面1cm以下取MLST增菌液0.2mL加到装有5mL BHI的小试管中，混匀，（36±1）℃恒温水浴4h，液面要高于试管中培养基高度。
（二）模板DNA的提取
取BHI增菌液1.5mL，10000r/min离心2min，尽量倒尽上清液。按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNA溶于50μL TE中。剩余BHI增菌液（36±1）℃恒温过夜培养，以备验证试验使用。
（三）PCR扩增
反应体系体积为50μL：10×PCR缓冲液5μL、引物对（10μmol/L）各2μL，dNTP（10mmol/L）1μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、水38.5μL、模板DNA1μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃下保存。
（四）质控
检验过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌到10mL NB中，（36±1）℃过夜培养，各取1.5mL增菌液，离心，提取DNA模板。阪崎肠杆菌DNA模板作阳性对照，金黄色葡萄球菌DNA模板作阴性对照，空白对照加水1μL。
（五）PCR扩增产物电泳检验
用0.5×TBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖电泳凝胶并趁凝胶未凝固时加入溴化乙啶使其最终浓度达到1μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将7.5μL PCR扩增产物分别和1.5μL6×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入100bpDNA ladder，9V/cm恒压，电泳20～30min紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。
（六）废弃物处理和防止污染的措施
检验过程中的废弃物，收集后焚烧处理。
检验过程中防止交叉污染的措施。
实验结果与报告
（一）PCR扩增产物电泳检验结果
阪崎肠杆菌PCR扩增产物为282bp。
（二）结果判断
阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带；待测样品出现预期大小的扩增条带，怀疑存在阪崎肠杆菌，需进一步确证；待测样品未出现预期大小的扩增条带，为阴性结果。
（三）验证试验
取（36±1）℃恒温培养的相应BHI增菌液接种于VRBGA及X-α-GlcA中，挑取可疑菌落并进行鉴定。
（四）结果表述
PCR扩增产物电泳检验结果阳性，且经确证为非假阳性，每100g乳粉中检出阪崎肠杆菌。
PCR扩增产物电泳检验结果阴性，每100g乳粉中未检出阪崎肠杆菌。
思考题
用普通PCR方法检测婴儿乳粉中阪崎肠杆菌应注意哪些问题？
