实验目的
（1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
（2）学习并掌握大肠菌群的检验方法。
实验原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或mL）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number，简称MPN）表示。
实验材料
（一）样品
乳粉、巴氏消毒乳、乳饮料或其他食品。
（二）菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）。
（三）培养基及试剂
单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管（培养基66）、乳糖发酵管（培养基67）、伊红美蓝琼脂（EMB）（培养基71）、革兰氏染色液。
（四）仪器及其他用品
恒温箱、恒温水浴、药物天平、培养皿、载玻片等。
实验流程
（一）一般检样大肠杆菌检验程序
（二）乳粉和消毒乳检样大肠杆菌检验流程
实验步骤
取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同，做成1：10的均匀稀释液为检样。同一稀释度在做菌落总数测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并用大肠杆菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。
（一）乳糖发酵试验
根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管。接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠杆菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支单料乳糖胆盐发酵管作对照。置（36±1）℃温箱内，培养（24±2）h，如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。
（二）分离培养
将产气的发酵管分别在伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置（36±1）℃温箱内，培养18～24h后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
（三）证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）℃温箱培养（24±2）h，观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
（四）报告
根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。
查表注意：在MPN检索表第一栏阳性管数下所列出的1mL（g），系指原样品（包括液体和固体）的1mL（g）数，并非样品稀释后的1mL（g）数，对固体样品更应注意。如固体样品1g经10倍稀释后，虽加入1mL量，但实际其中只含有0.1g样品，故应按0.1g计，不应按1mL计。
方法举例：若含1g检样量的3管中经发酵证实其中有2管产气，而含有0.1g检样量的3管中证实其中有1管产气。含0.01g检样量的3管中证实均不产气，则根据“2、1、0”查，得MPN=150，可以报告每100mL（g）检样中大肠菌群的MPN值为150.
实验结果
（一）试验结果与报告
试验结果填入。
（二）结果报告
根据证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数。
思考题
（1）大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？
（2）做空白对照实验的目的是什么？
（3）为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？
（4）复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？
（5）大肠菌群检验程序中哪些是最关键的步骤？如果出现结果误差，请分析原因。
（6）你所检测的乳粉检样中的大肠菌群数为多少？是否符合国家标准？
注：特级全脂乳粉食品卫生国家标准：菌落总数（CFU/g）≤20000；大肠菌群（MPN/100g）≤40.
