一、乳品中细菌总数的测定
实验目的
（1）学习并掌握标准平皿活菌计数的基本方法和原理。
（2）了解菌落总数测定在对被检样品进行卫生学评价中的意义。
实验原理
平皿菌落计数法又称标准平板活菌计数法（standard plate count，简称SPC法）是最常用的一种活菌计数法。它是根据微生物在高度稀释条件下于固体培养基上所形成的单个菌落，是由一个单细胞繁殖而成，这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，根据待检样品的污染程度，做10倍递增系列稀释，制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使之呈单个细胞存在，选择其中2～3个稀释度，使至少有一个稀释度的平均菌落数在30～300之间，再取一定量的稀释液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经恒温培养后，由单个细胞生长繁殖形成单菌落，统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的活菌数。
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便为被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数。由于菌落总数是在普通营养琼脂上，37℃有氧条件下培养的结果，故厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌生长也受到限制。因此，SPC法所得的结果实际上只包括一群在普通营养琼脂中生长、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。此外菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。菌落总数可作为判定食品卫生程度（被污染程度）的标志，通常卫生程度越好的食品，单位样品的菌落总数越低，反之菌落总数就越高。
实验材料
（一）检样
乳粉、巴氏消毒乳等。
（二）培养基
营养琼脂培养基（培养基4）、无菌生理盐水。
（三）仪器及其他用品
无菌培养皿、无菌移液管、无菌不锈钢勺。
实验流程
检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2或3个适宜稀释度各以1mL分别加入灭菌平皿中→每皿内加入适量营养琼脂[（36±1）℃，（48±2）h]→菌落计数→报告
实验步骤
（一）取样、稀释和培养
以无菌操作取检样25g（25mL），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10mL吸管。
根据标准要求或对污染情况的估计，选择2或3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，用吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
稀释液移入平皿后，将凉至46℃（不烫手）营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
待琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃温箱内培养（48±2）h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每1g（每1mL）样品所含菌落总数。
（二）菌落计数方法
做平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。
（三）菌落计数报告方法
1.平皿菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用2～3个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的1/2，而其余1/2中菌落分布又很均匀，则可以计算1/2个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
2.稀释度的选择
（1）应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告。
（2）若有2个稀释度均在30～300之间，应由二者比值决定：比值≤2取平均数；比值＞2则取其较小数字。
（3）若所有稀释度均＞30，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
（4）若所有稀释度均＜30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告。
（5）若所有稀释度均无菌落生长，则应按＜1乘以最低稀释倍数报告。
（6）若所有稀释度均不在30～300之间，有的＞300，有的又＜30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
3.菌落计数报告方法
菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
实验注意事项：
（1）水溶性或能在水中制成悬浮液的固体样品（如土样、面粉、乳粉、糖），在称取样品后，加入无菌生理盐水制成稀释液，并按上述方法计数；有些固体样品（如乳酪、肉等）需在无菌生理盐水中浸泡，并用乳钵研磨得到悬浮液。一般稀释液包括生理盐水、蛋白胨水、蛋白胨盐稀释液。对于不同食品或产品，操作步骤有所不同。为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC（氯化三苯四氮唑），每100mL琼脂加1mL0.5%TTC，培养后，细菌生成红色菌落，而与不显色的食品颗粒区别开来。
（2）目前还有几种快速检测菌落总数的方法，如由军事医学科学院研制而成的食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法，操作简便，不易受污染，结果与SPC法一致。另一种是由美国3M有限公司提供的PetrifilmPlates测试片（菌落总数测试片）。由于测试片中含有TTC红色指示剂，使所有菌落易于识别计数。该法与SPC法比较，操作简便而快速，测试结果相关系数为0.99，目前已得到美国AOAC的认可。
（3）整个实验程序中要求严格无菌操作，避免杂菌污染，以免影响实验结果的判定。
（4）用倾注平板培养法时，熔化后的培养基要冷却至46℃才能倒入盛有菌液的平板，同时要迅速旋动平板。
（5）前一稀释度的平均菌落数应大致为后一稀释度平均菌落数的10倍左右，若差别太大应重做。若菌落稠密或长成菌苔严重的平板，不能用来计数。
实验结果与报告
（1）将实验测出的样品中的细菌总数结果记入，并对结果进行误差分析。
（2）对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。
思考题
（1）食品检验为什么要测定细菌菌落总数？
（2）实验操作如何使数据可靠？
（3）食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？
（4）为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在（46±1）℃的温度？
（5）假设你在测某一食品的菌落总数时，出现了高稀释度样品的菌落数大于低稀释度样品的菌落数，请分析可能有哪些原因造成。
二、乳制品中酵母菌和霉菌菌落总数的测定
实验目的
（1）熟悉并掌握酵母菌和霉菌的标准平板活菌计数法。
（2）明确对被检样品进行酵母菌和霉菌菌落总数测定的卫生学意义。
实验原理
乳制品和牛饲料很容易受到霉菌的侵染，如炼乳、酸乳和青贮饲料感染霉菌后常发生霉坏变质，有些霉菌如青霉、黄曲霉和镰刀霉产生毒素，侵染乳品和饲料机会较多，因此，对乳制品加强霉菌的检验，在食品卫生学上具有重要意义。
霉菌和酵母菌菌落计数方法与细菌SPC方法相似。不同之处在于所用培养基必须选择抑制细菌生长的选择性培养基。培养温度一般为25～28℃，培养时间为3～5d后观察菌落，计算方法通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数。同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每1g（1mL）检样中所含霉菌和酵母菌数量。目前，我国对霉菌和酵母菌的菌落计数常用培养基是高盐（渗）察氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基（加氯霉素）和孟加拉红培养基。前一种培养基利用高渗抑制细菌或酵母菌的生长，通常用于检测粮食和饲料中的霉菌数量；后两种培养基均含有氯霉素可抑制细菌生长，通常用于检测其他样品的霉菌和酵母菌数量。
霉菌和酵母菌菌落总数测定是指检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落总数（粮食和饲料样品是指1g粮食或饲料表面的霉菌总数）。霉菌和酵母菌数主要作为判定乳制品和饲料被霉菌和酵母菌污染程度的标志，以便对检样进行卫生学评价。
实验材料
（一）检样
干酪或青贮玉米。
（二）培养基
孟加拉红培养基（培养基31）、马铃薯葡萄糖培养基（加氯霉素）（培养基27）、高盐察氏培养基（培养基23）。
（三）试剂
无菌水（9mL/管，225mL/三角瓶，内含适量玻璃珠）、75%酒精棉球。
（四）仪器及其他用品
无菌平皿、无菌吸管、无菌称量纸、灭菌金属勺或刀、灭菌剪刀、灭菌镊子、无菌吸管（1mL、10mL）、橡皮乳头、试管、带玻塞三角瓶、广口瓶、载玻片、盖玻片、酒精灯、电子天平（0.01g）、培养箱、显微镜、振荡器、微波炉、灭菌研钵等。
实验流程
实验步骤
（一）采样
采样时须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染，首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀或勺等，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
青贮饲料样品的采集，可根据青贮堆垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部分的混合样品。
乳与乳制品以及其他液体食品，灭菌工具采集可疑霉变食品250g（mL），装入灭菌容器内送检。
（二）编号
取无菌平皿数套，分别用记号笔标明不同的稀释度各2套。另取数支9mL无菌水的试管，依次标明其稀释度。
（三）样品的稀释
以无菌操作，称取检样25g（25mL），放入含有225mL无菌水的带玻塞三角瓶中，振摇30min，即为10-1稀释液。用灭菌吸管吸取10-1稀释液10mL，注入灭菌试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。取1mL10-1稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换1支1mL灭菌吸管吹吸10余次，此液为10-2稀释液。以下操作顺序按10倍递增稀释法进行，制备10-3、10-4系列稀释液，稀释方法与SPC法相同。
（四）平板培养
根据对样品污染情况的估计，选择3个合适稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将冷却至45%左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
（五）菌落计数方法
与细菌菌落总数测定实验相同。
（六）计算方法
通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同一稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每1g或每1mL食品中所含霉菌和酵母菌的菌落形成单位数（CFU）。
实验结果与报告
（1）将测出样品中的霉菌和酵母菌的菌落总数结果。
（2）报告检测结果，判断所测样品的菌落总数是否符合卫生要求。
思考题
影响霉菌和酵母菌菌落计数准确性的因素有哪些？哪些步骤容易造成实验结果的误差？
