微生物的鉴定不仅是微生物分类学中一个重要组成部分，而且也是在具体工作中经常遇到的问题。一般来说，对一株从自然界或其他样品中分离纯化的未知菌种进行经典分类鉴定，需要做以下几方面的工作：
①个体形态观察：对未知菌种进行革兰氏染色，辨别是G+菌，还是G-菌，并观察其形状、大小、有无芽孢及其着生位置等。
②菌落形态观察：对未知菌种进行形态、大小、边缘情况、表面情况、隆起度、透明度、色泽、质地、气味等菌落特征观察。
③动力试验：观察未知菌种能否运动及其鞭毛类型（端生、周生）。
④生理生化反应试验：细菌的代谢与呼吸作用主要依赖酶的活动，各种细菌具有不同的酶类而表现出对某些碳水化合物、含氮化合物的分解代谢途径以及代谢类型等方面均有差异，故可利用这些差异作为细菌分类鉴定的重要依据之一。
⑤血清学反应试验：该反应具有特异性强、灵敏度高、简便快速等优点，在微生物分类鉴定中，常用已知菌种制成抗血清，根据它是否与未知菌种发生特异性结合反应来鉴定，判断它们之间的亲缘关系。
⑥根据以上试验项目的结果，查阅权威性的菌种鉴定手册中微生物分类检索表，给未知菌种对号入座进行鉴定和分类。
生理生化反应试验项目很多，本实验针对肠杆菌科各属细菌的分类鉴定，选择其中重要的几项进行试验。
一、糖（醇）类发酵试验
实验目的
了解糖发酵的原理及其在肠杆菌科各属细菌鉴定中的重要作用。掌握糖发酵鉴别不同微生物的方法。
实验原理
糖（醇）发酵试验是最常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们分解糖类物质的能力有很大差异。有些细菌能分解某种单糖或醇产生有机酸（如乳酸、甲酸、醋酸、丙酸、琥珀酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒沙门氏菌分解葡萄糖产酸不产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基中含有不同的糖类、蛋白胨和溴甲酚紫（简称B。C。P）指示剂，以及倒置的杜氏小管。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色（pH6.8以上）变为黄色（pH5.2以下）。气体的产生可由倒置的杜氏小管中有无气泡来证明，或用半固体培养基穿刺接种法亦能判别产气现象。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella sp。）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）斜面培养物各1支。
（二）培养基
葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇液体培养基（内装有倒置的杜氏小管）或半固体发酵培养基试管各6支（培养基51）。
（三）仪器与其他用具
酒精灯、接种环、接种针、记号笔、试管架等。
实验流程
制备糖发酵培养基→液体接种→半固体穿刺接种→适温培养→结果报告
实验步骤
（一）液体接种
取5种糖发酵液体培养基试管各5支，用接种环分别接入大肠杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌，第5支不接种，作为空白对照。接种后，轻缓摇动试管（防止倒置的小管进入气泡），使其均匀，在各试管外壁上分别注明菌名和培养基名称，置于37℃培养1～2d，观察各试管颜色变化及杜氏小管中有无气泡。
（二）半固体穿刺接种
取5种糖发酵半固体培养基试管各5支，分别用接种针穿刺接入大肠杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌，第5支不接种，作为空白对照，在各试管外壁上分别注明菌名和培养基名称，置37℃培养1d后观察结果。
实验结果与报告
将观察到的糖（醇）类发酵试验结果用注解符号中。
思考题
（1）假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
（2）在糖发酵试验中，为什么大肠杆菌发酵葡萄糖能产酸产气？而产气肠杆菌发酵葡萄糖则主要产生中性乙酰甲基甲醇？
二、IMViC与硫化氢试验
实验目的
了解IMViC与硫化氢试验反应的原理及其在肠杆菌科各属细菌鉴定中的意义和方法。
实验原理
IMViC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验（metyl red test，简称M。R试验）、V-P试验（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐试验（citrate test）4个试验的缩写（i是在英文中为了发音方便而加上去的）。这4个试验主要用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌等肠道杆菌科的细菌，多用于食品和饮用水的细菌学检验。大肠杆菌作为食品和饮用水的粪便污染指示菌，若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌存在于水、植物、谷物表面和食品中，也可作为食品和饮用水的粪便污染指示菌。但在检验时要将两者鉴别区分。
（一）吲哚试验
用于检测细菌分解色氨酸产生吲哚（靛基质）的能力。有些细菌，如大肠杆菌能产生色氨酸水解酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色的玫瑰吲哚，为阳性反应，而产气肠杆菌为阴性反应。
（二）甲基红试验
用于检测细菌分解葡萄糖产生有机酸的能力。当细菌代谢糖产生有机酸时，使加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。例如，大肠杆菌先发酵葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解为有机酸（甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等），由于产酸量较多，使培养基的pH降至4.2以下，此时加入甲基红指示剂呈红色，为阳性反应；而产气肠杆菌分解葡萄糖产生有机酸量少，或产生的有机酸又进一步转化为非酸性末端产物（如醇、醛、酮、气体和水等），使pH升至大约6.0，此时加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。
（三）V-P试验
用于检测细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌，如产气肠杆菌分解葡萄糖产生的丙酮酸又进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇（3-羟基丁酮），此化合物在碱性条件下易被空气中的氧气氧化成二乙酰（丁二酮），二乙酰与培养基蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即V-P试验阳性反应；而大肠杆菌不产生红色化合物，为阴性反应。若在培养基中加入少量α-萘酚或肌酸（0.3%）、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反应。
（四）柠檬酸盐试验
用于检测肠杆菌科各属细菌利用柠檬酸的能力。有的细菌，如产气肠杆菌等能够利用柠檬酸钠为碳源。由于细菌不断利用柠檬酸产生CO2，CO2与培养基中的Na+、H2O结合形成碳酸钠，导致培养基碱性增加，使培养基中溴麝香草酚蓝指示剂由绿色（pH6.0～7.0）变为蓝色（pH大于7.6），即为阳性反应；而大肠杆菌不能利用柠檬酸盐，即为阴性反应。
（五）硫化氢试验
用于检测肠杆菌科各属细菌分解含硫氨基酸释放硫化氢的能力。有些细菌，如沙门氏菌、变形杆菌等能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等）产生硫化氢，遇到培养基中的铅盐（醋酸铅）或铁盐（FeSO4）等，生成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。以半胱氨酸为例。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella sp。）、产气肠杆菌（Entero-bacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）斜面培养物各1支。
（二）培养基
童汉氏蛋白胨水培养基（培养基35）、葡萄糖蛋白胨水培养基（培养基46）、西蒙氏柠檬酸盐斜面培养基（培养基52）、醋酸铅或硫酸亚铁半固体培养基（培养基34和36）。
（三）试剂
甲基红指示剂、40%KOH、5%α-萘酚无水乙醇溶液（或肌酸）、乙醚、吲哚试剂等（见附录III）。
（四）仪器及其他用品
酒精灯、接种环、接种针、记号笔、试管架等。
实验流程
斜面培养物→接入童汉氏蛋白胨水培养基→葡萄糖蛋白胨水培养基→西蒙氏柠檬酸盐斜面培养基→穿刺接入醋酸铅半固体培养基→37℃培养2d→分别进行吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、柠檬酸盐试验和H2S试验
实验步骤
（一）吲哚试验
将上述四种菌分别接入5支童汉氏蛋白胨水培养基试管中，第5支不接种，作为空白对照，置37℃培养2d后，加入3～4滴乙醚，经充分振荡使吲哚萃取于乙醚中，静置1～3min，待乙醚浮于培养基液面后，沿试管壁徐徐加入数滴（约0.5mL）吲哚试剂，静置勿摇动，液面有玫瑰红色环者为阳性反应。
（二）V-P试验
将上述四种菌分别接入5支葡萄糖蛋白胨水培养基中，第5支不接种，作为空白对照，置37℃培养2d后，取出试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5mL以上对应管中的培养液，加入5～10滴40%KOH，并用牙签挑入0.5～1.0mg肌酸或加入等量5%的α-萘酚无水乙醇溶液，用力振荡试管，以使空气中的氧溶入，置于37℃温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色者为阳性反应，黄色者为阴性反应。注意：原试管中留下的培养液用于甲基红试验。
（三）甲基红试验
于V-P试验留下的培养液中，各加入甲基红试剂2～3滴，应沿管壁加入，若培养液的上层变成红色者为阳性反应，仍呈黄色者为阴性反应。注意：甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。
（四）柠檬酸盐试验
将上述四种菌分别接入5支西蒙氏柠檬酸盐培养基斜面，第5支不接种，作为空白对照，置37℃培养2～4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌苔生长，培养基由绿色转为蓝色；阴性者仍为培养基的绿色。
（五）硫化氢试验
将上述四种菌分别用接种针沿试管壁穿刺接入5支醋酸铅或硫酸亚铁半固体培养基中，第5支不接种，作为空白对照，置37℃培养1～2d，观察结果。产硫化氢者使培养基变黑，为阳性反应。
实验结果与报告
思考题
（1）讨论IMViC试验在微生物学检验上的意义。
（2）解释吲哚试验的反应原理，做吲哚试验可用什么样的合成培养基代替蛋白胨水？为什么用吲哚作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
（3）为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？该试验与V-P试验最初底物与最终产物有何异同？为什么？
（4）在硫化氢试验中，说明醋酸铅的作用。还可用哪种化合物代替醋酸铅？
（5）细菌生理生化反应试验中为什么设有空白对照？
（6）现分离到一株肠道细菌纯培养菌株，试结合本试验设计一个方案鉴定之。
三、其他生理生化试验
实验目的
了解硝酸盐还原试验、尿素分解试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、石蕊牛乳试验、H2O2酶试验、氧化酶试验、OF试验反应的原理及其在肠道杆菌科细菌鉴定中的意义和方法。
实验原理
（一）硝酸盐还原试验
用于检测细菌是否具有硝酸盐还原酶的活性。该酶能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐或氨和氮气等。如果细菌将硝酸盐还原为亚硝酸盐时，当培养基中加入亚硝酸试剂（亦称格里斯试剂）后，亚硝酸盐与其中的对氨基苯磺酸作用，生成对重氮苯磺酸，后者再与α-萘胺结合生成红色的N-α-萘胺偶氮苯磺酸，此为阳性反应。其化学反应过程如下：
如果在培养基中加入格里斯试剂后培养液不呈现红色，则有两种可能：一是细菌不能还原硝酸盐，培养液中仍有硝酸盐存在，此为阴性反应。二是细菌还原硝酸盐生成的亚硝酸盐又继续分解生成氨和氮，此为阳性反应。
判断培养液中硝酸盐是否存在，可用两种方法检查。第一种方法是在培养液中加入1～2滴二苯胺试剂，如果培养液呈蓝色，表示有硝酸盐存在，此为阴性反应；若不变蓝，表示硝酸盐不存在，此为阳性反应。第二种方法是在培养液中加入少量锌粉，经加热后，锌粉使硝酸盐还原为亚硝酸盐，再加入格里斯试剂，若培养液呈现红色，说明原来的硝酸盐未被还原，此为阴性反应；如果培养液不呈现红色，则说明培养液中已不存在硝酸盐，此为阳性反应。
（二）尿素分解试验
用于检测细菌是否具有尿素酶的活性。具有尿素酶的细菌，如变形杆菌等可以分解培养基中的尿素产生氨，使培养基中的酚红指示剂由黄色（pH6.3～6.8）变成红色（pH8.0～8.4）。
（三）苯丙氨酸脱氨酶试验
用于检测细菌分解苯丙氨酸的脱氨作用。具有苯丙氨酸脱氨酶的细菌，可使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，而苯丙酮酸与FeCl3，反应生成绿色化合物。
（四）氨基酸脱羧酶试验
用于检测细菌分解氨基酸的脱羧作用。具有氨基酸脱羧酶的细菌可使基础培养基中的L-赖氨酸和L-鸟氨酸脱羧产生CO2，CO2再与培养基中的水和氢氧化钠反应生成碳酸盐，使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色（pH6.0～7.0）变为蓝色（pH大于7.6）。
（五）石蕊牛乳试验
用于检测细菌对牛乳的分解和利用情况。牛乳中含有大量的乳糖、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖和酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部褪色变白。细菌对牛乳的分解和利用可分以下三种情况。
1.酸凝固作用
分泌乳糖酶的细菌能发酵乳糖产生乳酸后，使石蕊牛乳变红，当酸度较高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。若发酵乳糖产酸的同时又产生气体，可冲开覆盖于培养基上的凡士林。
2.凝乳酶凝固作用
某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种菌还具有酪蛋白水解酶，能分解酪蛋白产生氨和胺类等碱性物质，使石蕊牛乳变蓝色或紫蓝色，同时使牛乳变得清亮。
3.胨化作用
分泌蛋白酶的细菌水解酪蛋白，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性或碱性条件下进行。有时石蕊色素呈红色或蓝色，有时因细菌旺盛生长，使培养基氧化还原电位降低，使石蕊被还原而褪色。
若发酵剧烈，产酸、产气、凝固、胨化同时产生的现象称汹涌发酵。此现象为产气荚膜梭菌所特有。细菌能否在牛乳中产酸凝固或分解酪蛋白胨化，决定于其本身的特性（主要指酶系统）。因此，细菌利用和分解牛乳的不同反应现象，即可作为鉴定细菌的依据。
（六）H2O2酶试验
用于检测细菌是否具有H2O2酶的活性。许多好氧菌和兼性厌氧菌，如葡萄球菌、肠道杆菌科的细菌等具有H2O2酶活性，能催化H2O2释放出大量氧气，形成气泡。厌氧菌不具有H2O2酶活性。
（七）氧化酶试验
用于检测细菌是否具有氧化酶的活性。具有氧化酶的细菌，如乳酸细菌等能将盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化成红色的醌类化合物，继而颜色逐渐加深，此为氧化酶试验阳性反应。
（八）OF试验
用OF基础培养基来鉴别各种G-菌对糖类的发酵型或氧化型的代谢作用。如果将一种G-菌接种于两支含一种糖类的OF基础培养基试管中，其中一管上面覆盖矿物油以隔离氧气；另一管不覆盖OF可以观察到具有鉴别意义的反应。发酵型细菌在两管培养基中均产生酸性产物，培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色（pH6.0～7.0）变为黄色（pH小于6.0）；氧化型细菌则在未覆盖矿物油的试管中产生酸性产物，而在覆盖矿物油的培养基中只有轻度生长，甚至没有生长，也无反应变化；对于非发酵型和非氧化型的细菌则覆盖矿物油试管不发生变化，而未覆盖矿物油试管产生碱性产物，培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色（pH6.0～7.0）变为蓝色（pH大于7.6）。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella sp。）、产气肠杆菌（Entero-bacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）斜面培养物各1支。
（二）培养基
硝酸盐培养基（培养基53）、尿素培养基（液体或斜面）（培养基42）、苯丙氨酸培养基（培养基33）、氨基酸脱羧酶试验培养基（培养基32）、石蕊牛乳（淡紫色）培养基（培养基50）、营养琼脂培养基（培养基4）、OF基础培养基（培养基45）等。
（三）试剂
格里斯试剂A液和B液、二苯胺试剂（或锌粉）、100g/L FeCl3溶液、3%H2O2、盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯三胺试剂、1%α-萘―醇溶液、无菌液体石蜡。
（四）仪器及其他用品
酒精灯、接种环、接种针、无菌吸管、滤纸、记号笔、试管架等。
实验流程
斜面培养物→生理生化试验（硝酸盐还原试验、尿素分解试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、石蕊牛乳试验、H2O2酶试验、氧化酶试验、OF试验反应）→结果报告、填表
实验步骤
（一）硝酸盐还原试验
1.好氧菌硝酸盐还原试验
接种大肠杆菌或产气肠杆菌于硝酸盐液体培养基中，并以1管不接种作空白对照，37℃培养2～4d后，用干净的空试管将培养液分成两管，其中一管滴入格里斯试剂A液和B液各1滴，对照管也同样分成两管，其中一管加入A、B液各1滴，观察颜色变化。如立刻或数分钟内显红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示有亚硝酸盐存在，此为阳性反应。如果不出现红色，则在另一管中加入1～2滴二苯胺试剂，若呈现蓝色为阴性反应，若不呈现蓝色为阳性反应。注意：此试验要避免接触含铁物质。若遇铁即出现假阳性反应。
2.厌氧菌硝酸盐还原试验
接种厌氧细菌于厌氧菌的硝酸盐培养基中，进行厌氧培养后加入格里斯试剂。其实验方法和观察结果与好氧菌硝酸盐还原试验相同，但培养时间为1～2d即可。
（二）尿素分解试验
将沙门氏菌和普通变形杆菌纯培养物以无菌操作接种于尿素培养基（液体或斜面）内，置于37℃温箱培养1d后观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。若在4d内培养基仍为黄色，判为阴性反应。
（三）苯丙氨酸脱氨酶试验
接种多量大肠杆菌和普通变形杆菌于苯丙氨酸培养基斜面上，37℃培养18～24h后，滴入4～5滴100g/L的FeCl3溶液于长菌斜面上，变绿色者为阳性反应。
（四）氨基酸脱羧酶试验
挑取待检细菌琼脂斜面纯培养物，接种于装有氨基酸脱羧酶试验培养基的小试管内，上面覆盖一层无菌液体石蜡，以防产生的CO2逸出。于（36±1）℃培养18～24h，观察结果。如以溴甲酚―醇溶液为指示剂，氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。如用溴麝香草酚蓝为指示剂，培养液变蓝色者为阳性反应。
（五）石蕊牛乳试验
将大肠杆菌、普通变形杆菌等纯培养物接种于石蕊牛乳培养基试管中，连同空白对照管于37℃培养2～3d后观察结果。如果石蕊牛乳褪去淡紫色，恢复牛乳颜色，表明产酸；牛乳变得黏稠不易流动者，为凝固；石蕊牛乳变蓝色者，表明产碱；牛乳变澄清者，为胨化。若在7d后培养基仍无变化，此为阴性反应。
注意事项：
（1）石蕊在牛乳中随时间延长而下沉。使用前要摇匀。而在观察时，勿摇动试管。
（2）接入菌种培养产酸时，一般不呈现红色。而是石蕊牛乳的淡紫色消退，但是延长培养时间，表面出现浅红色。
（3）由于牛乳的产酸、凝固和胨化现象为连续相继变化，因此，必须连续观察结果。当观察到某种现象（如胨化）出现的同时，另一种现象已经消失。
（六）H2O2酶（接触酶）试验
用无菌吸管（或无菌胶帽滴管）吸取3%H2O2溶液0.5mL，滴加到大肠杆菌、产气肠杆菌等普通营养琼脂平板的菌落上，出现气泡者为阳性反应。此外，还可用接种环挑取平板菌落或斜面菌苔一小环，涂抹于已滴有3%H2O2的干净载玻片上，于30s内如有气泡产生即为阳性反应，不发生气泡者为阴性。以第二种方法为好。注意：用于培养试验菌的培养基中不能含有血红素或红血球，否则产生假阳性反应。
（七）氧化酶试验
用白色洁净滤纸条蘸取待检细菌菌落少许，加盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂1滴，如立即出现红色者为阳性反应，而后颜色逐渐加深。再加1%α-萘―醇溶液1滴，阳性者于30s内呈现鲜蓝色，阴性者于2min内不变色。也可将上述试剂直接滴加到可疑菌落上，若菌落不久变为红色，经淡紫黑色最后为紫黑色者为氧化酶阳性反应，若要分离该菌时，应在菌落变紫黑前立即移植，否则细菌容易死亡。注意：培养物中不应含有血液或体液，因其中含有H2O2酶，易出现假阳性反应。
（八）OF试验
将待鉴别细菌培养物以无菌操作穿刺接种于OF基础培养基试管2支，其中一支覆盖矿物油（灭菌液体石蜡）以隔绝氧气，另一支不加，置37℃温箱培养1～2d后，观察反应现象。如果两管培养物均由绿色变黄色，则为发酵型细菌；若其中一管未加石蜡的培养物由绿色变黄色，而另一管加石蜡的培养物颜色无变化，轻微生长或不生长者为氧化型细菌；如果其中一管未加石蜡的培养物由绿变蓝色，而在加石蜡管中不发生变化者为非发酵型和非氧化型细菌。
实验结果与报告
思考题
（1）说明硝酸盐还原试验对细菌的生理意义。能进行硝酸盐还原反应的细菌属于化能自养菌还是化能异养菌？它们是进行有氧呼吸还是无氧呼吸或发酵？
（2）利用石蕊牛乳试验，可以观察到试验菌的哪些特性？
（3）H2O2酶对好氧菌的生活有何意义？
