概述
一、组织工程学原理
过去40年中，传统材料如金属材料、陶瓷材料和高分子材料在组织与器官的修复和移植中发挥了巨大的作用。然而，传统材料在体内终究是异物，永久性植入材料在体内存在着磨损、性能下降及安全性等问题；暂时性植入材料也存在着力学性能是否匹配、降解产物在体内的生物相容性及代谢途径等问题。而组织工程学的出现，为人们寻找更为理想的体内植入材料开辟了一条新的途径。
组织工程学虽然刚刚诞生不久，早在它命名之前在生物医学工程领域中就已经有了这方面的研究，这一术语是1987年提出的，其定义为：“应用工程学和生命科学的原理及方法来了解正常的和病理的哺乳类组织的结构功能的关系，并研制活的生物组织代用品，用于修复、维持、改善人体组织的功能。”在后一任务中包含了组织工程学的精髓，即为了恢复或替代组织和器官的功能而研制可移植部件或装置时，除了用细胞外基质（extracellular matrix，简称ECM，天然的或合成的）之外，还要用活细胞，因此，材料科学和细胞生物学、细胞工程学在组织工程学的研究中占据非常重要的地位。
组织工程学的定义包含两部分内容，而人造血管的研究就是涉及这两部分内容的典型例子。人们在研制人造血管之前，首先必须对血管的生物学结构与功能的关系了解清楚，即必须研究血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的结构与功能、它们的相互作用、细胞外基质的作用以及两种细胞周围环境的影响（包括其表面上作用的机械应力）；在此基础上才能进一步研制具有良好血液相容性、合适的内径及一定机械强度的人工血管材料。
组织工程学最有发展前途的领域之一是把培养的细胞包围起来制成生物代用品，应用这一技术的主要领域就是研制人造生物器官，例如人造软骨、人造骨、肌腱、肌肉、皮肤、肝脏、胰腺、血液、管状结构的组织，包括输尿管、膀胱与尿道、心脏瓣膜、血管等。这种以生物替代为目的，研究和开发关于修复和改善人体组织（包括部分器官）功能和形态的新兴学科即组织工程学，从根本上解决了组织和器官缺损所致的功能障碍或丧失的治疗问题，同时，也对生物材料的合成、加工方式、形态结构等提出了一系列新的要求。应用组织工程学原理研制人造生物器官其基本方法是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质（ECM）上。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换以除废料，使细胞按预制形态的三维支架生长。然后将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位。种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。
二、组织工程学的产生与发展
（一）组织工程学产生的历史背景
在人类的保健中，器官、组织的缺损或衰竭是发生最频繁、最具破坏性和花费最高的问题之一。医生通过个体间器官的移植、外科再造及利用诸如肾透析器之类的机械装置来治疗器官、组织的缺损。虽然上述疗法曾拯救或延长了少数人的生命，但并不完美。器官移植中所用替代物包括异体、同种异体、自体组织和人工合成材料，但这些替代物由于种种问题均不能很好地满足需要。
在异体移植中异种组织常常易引起相关快速的排斥反应；同种异体移植虽然在形态方面与自体组织相似，在术后早期可被宿主短时间接受，但排斥反应不可避免，且组织器官来源有限（如美国每年死于肝衰竭的病人约有3万，而可用的供体不足3000），自体组织移植会造成自体移植部位损伤，存在供给组织来源局限的问题；人工合成物质植入后所引起的异物反应、继发感染等，这些都迫使科学家们寻求新的、更为理想的组织替代物。
此外，外科再造术会留下后遗症，如治疗尿失禁将尿引入结肠后会增加结肠癌的发病率。人类器官往往具有多种功能，而采用机械装置并不能替代某一器官的所有功能，因此很难防止病情恶化。
从细胞工程学的角度看，早在20世纪50年代，市场上可应用的营养素（nutrients）和酸可将组织离解为有功能的细胞成分，从而开始了体外细胞培养的研究。细胞工程的诞生使大规模细胞培养成为可能。进入80年代以后，随着组织类型培养技术（histotypic culture techniques）的普及，以及对体外细胞相互作用的研究，预示着重建有功能的组织的到来。
而生物医用材料的研究已从生物惰性材料发展为生物活性材料和生物可吸收降解材料。目前，所研究的大多数生物可降解材料的降解产物为天然小分子，并能参与人体内的新陈代谢，如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）等，这类材料的研究和应用为组织工程学的建立与发展奠定了良好的物质基础。
组织工程学就是在这种历史背景下产生的，它是一门跨学科的新领域，以包括生物工程、材料科学与工程、分子生物学、细胞生物学和临床医学等多学科为基础，是21世纪生物材料发展的重要方向之一。此外，计算机科学的发展，各类生长因子的发现与研究，也进一步促进了组织工程学的发展。
（二）组织工程学发展的历史回顾
早在1977年，Green曾试图将分离的软骨细胞移植于去钙的骨骼支架中，以复制软骨，结果以失败告终。这就启示了必须先要创制一种细胞传送装置（cell delivery device），才能使移植细胞得以成活和繁殖。不少学者都研究过应用各种天然物质来进行传送，但成功率不高。Wakitani（1989年）将软骨细胞埋植于胶原支架中进行培植，达到一定的细胞增殖，并维持它在培养基中的表型（phenotype），同时避免了细胞间变。Hay报告应用血浆黏胶作为一种赋形剂以修复软骨损伤获得有限性成功。胶原海绵亦曾被试用，但结构显示新生的透明样软骨和周围的软骨间仅获得二者脆弱的结合。
直到20世纪80年代，组织工程开始萌芽，以寻求一种能产生新的中胚层组织的载体。美国从1988年起，就由国家科学基金会（The National Science Foundation）提供研究基金和资助的方式建立了一系列实验室。日本也展开了相应的研究。1989年在全美力学工程学会（The American Society of Mechanical Engineers）的冬季年会上，日、美两国还就组织工程学举行了专题讨论会。
美国Vacanti首先于1988年研制了新的软骨组织。他使用了细胞分离和组织培养技术，同时应用了生物相容性好，并有生物降解性的合成材料（ECM）。1991年他们终于在小白鼠的皮下组织层，将小牛软骨细胞移植于未经编织的缝合线材料制成的支架上（它可以允许营养物质的渗入和进行气体交换）。软骨细胞吸附于纤维支架上，并分泌大量基质，最终形成新的软骨组织，获得成功。这些组织经初步检查和染色体切片检查，并应用荧光素标记，证实新生软骨来源于移植的软骨细胞。在实验初期，Vacanti等所采用的是未经编织的加Lyghicin
910缝线（即Vicryl缝线）和聚乙醇线（polyglycolic acid， PGA，即Dexon缝线）。以后又开始对上述材料的加工进行改善，如将PGA纤维加工制成直径为15mm的未编织网状体其纤维间隙控制在180～200μm；另一种是PGA与PLLAL型聚乳酸的混合物。逐渐地，细胞载体支架的形态、大小、降解时间和支架的细胞亲和力都可被正确地、有效地控制。此外，还可以测算在细胞聚合结构中最佳的细胞密度。
1992年，Vacanti终于成功地开发出一种与人体耳郭形态相似的合成物支架，并于1996年由曹谊林、Vacanti等在白鼠及兔体上制成有皮肤覆盖，并有血供的人形耳软骨，这为未来修复耳缺损病例开创了前所未有的发展前景。与此同时，Vacanti及Ghadially等也制成了有呼吸道上皮细胞覆盖的软骨管状体，并进行了动物实验，将来可望用来修复人体气管缺损。Granse于1989年在兔体上进行关节软骨面损伤修复的实验。以上几个实验证明，利用合成可降解的聚合物，结合细胞的培养繁殖和生长因子促进组织形成的过程，可以促进软骨再生，这种组织工程新技术可望很快发展成为一种在临床上普遍应用的新技术，并进一步发展，产生其他组织细胞，如骨骼、肌腱、肌肉等甚至可为肝、胰等细胞移植开辟道路。
三、组织工程学研究的内容和方法
1993年，麻省理工学院的Robett Langer在《Science》上撰文指出，组织工程学的三大要素为细胞的分离与培养、细胞生长因子及细胞载体材料。因此，组织工程学研究的主要内容可以概括为如下三方面。
1.特定组织的细胞
特定组织的细胞是指从供体组织的健康部位收集个体细胞，分离后，再移植到患者所需要的部位。细胞移植与整个器官移植相比具有明显的优势：因为分离的细胞数量可在体外通过细胞培养技术进行扩展；仅仅需要很少量的供体细胞就可进行移植；同时，活的供体不必牺牲整个器官。分离细胞的用处还可以排除易发生免疫反应的细胞类型，这样则排除了排斥反应的可能性。另外，还避免了供者与接受者由于手术所存在的固有危险。最后，整个费用也得到了降低。
2.细胞生长因子
在组织器官的再造中，各类组织诱导因子、生长因子和血管形成刺激因子将有利于组织的形成。
人们发现促进骨细胞的分化与再生的是一些蛋白质生长因子，其中起主要作用的是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins， BMP）。这种活性蛋白质可诱导血管周围游动间充质细胞转化为不可逆性骨系细胞，从而在骨骼或骨骼以外部位产生软骨和骨组织。20世纪60年代Urist最早发现BMP的存在，但对BMP的蛋白质的纯化和基因的克隆直到80年代末才完成，这些研究除证明BMP是正常胚胎时期骨、牙组织和成年骨修复中最重要的诱导分化因子外，还在BMP基因及其表达调节对靶细胞的作用、BMP的受体、BMP蛋白的结构与功能等方面都作了重要的探索。
实际应用中不能直接将生长因子（如BMP）植入体内，否则易被血液冲刷掉。因此，如何将生长因子与载体组合成生长因子的释放系统，是组织工程中有效利用生长因子的关键。
3.细胞载体材料
分离的细胞自身不可能形成组织，它们需要特殊的环境，通常包括细胞生长临时的支架材料（supporting materials）。这种三维支架材料常常模拟其自然对应物——体内的细胞外基质（extra cell materials， ECM），它们既起物理支架的作用，又是实质细胞（parechymal cell）在体外培养和后期植入的黏附物质（adhesive substrate）。由于对这种材料多功能的要求，因而它必须具备许多物理及化学性质。为能黏附大量的细胞，支架材料的设计首先必须具备很大的比表面积（surface ares）；所种植的细胞在生长及ECM的形成中需要充分合适的空间，因而支架材料的设计还需具有高的孔隙率（Porosity）。此外，支架材料必须具备内部均匀分布和相互联通的孔结构，这样有利于细胞在整个支架体内部均匀分布，也有利于新生成的组织成分形成三维有机网络结构。在结构组织如骨、软骨的修复中，组织的形态对其功能而言至关重要，所以支架材料还必须加工成不同的厚度和形状；由于细胞-支架材料复合体最终必须植入到体内骨及软骨损伤处，因此，支架材料除需具有通常所要求的良好的生物相容性外，还需具有一定的机械强度。最后，随着移植细胞数量的增加以及功能的正常化，细胞开始分泌出自己的ECM，人工支架材料的作用逐渐减弱，随着组织功能的恢复，这种支架通过生物降解最终消失（eliminated）。细胞载体材料是利用组织工程技术再造人类器官的物质基础，是组织工程技术中研究的关键。
细胞培养
细胞培养是指从体内取出的细胞或组织在模拟体内生理环境，于无菌、合适温度和一定营养条件下在体外培养，使其生存、生长、增殖，并保持其结构和功能的方法。它包括从活体中取出的细胞或已建立的细胞系在体外培养生长、增殖，但不再分化为组织。
一、培养细胞的生存条件
（一）无污染环境
由于体内存在强大的免疫系统和解毒器官（如肝等），对于入侵体内的有害物质，可进行防御和清除，使细胞免受危害。当细胞在体外培养时便失去了对微生物和有害物质的防御能力，一旦污染即导致细胞死亡。故环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
（二）基本的营养物质
培养细胞所需的营养物质与体内基本相同，除三大营养素外，也需一定的维生素、Ca2+、Mg2+等无机离子及微量元素等。由于培养细胞从培养基中摄取营养物，因此，培养基应满足以下要求。
（1）所有细胞均需要的12种氨基酸。精、胱、亮、异亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、组、酪和缬氨酸，这些氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。也需要谷氨酰胺，它既能促进氨基酸进入细胞膜，其所含的氮是核酸中嘌呤与嘧啶的来源，也是合成磷酸腺苷的必需物。
（2）含有适量的葡萄糖以维持细胞代谢及产生能量。
（3）必需的维生素：生物素、叶酸、烟酸胺、泛酸、吡哆醇、核黄素硫胺素等。
（4）钠、钾、钙、镁等无机盐类及铁、锌等微量元素。在大多数培养基中需加入血清，常用的有经灭活补体的胎牛、小牛、人AB型、马血清等。其确切功能尚不十分明确，可能为细胞提供了包括生长因子在内的多种微量蛋白成分。为了防止细菌感染，有时加入适量的抗生素（如青霉素、链霉素）。随着培养基商品化生产，为细胞培养提供了极大方便。常用的培养基有RPMIl640、TC199、MEM及DMEM等。这些培养基均系有明确配方的多种成分粉剂，使用时严格按厂家说明配制，经滤过除菌后即可使用或分装冷藏备用。由于各种细胞的培养方法不尽相同，实验者常需按不同细胞的要求添加不同的成分，如生长因子或细胞因子等，这种添加特殊成分的培养基又称条件培养基。
（三）温度
维持细胞生长，必须有适宜的温度（即相当于动物的体温），人和哺乳动物培养细胞的最适宜温度为35℃～37℃。偏离此范围，细胞的正常代谢和生长受影响。一般来说，细胞对低温的耐受力较高温强。温度上升不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；温度不低于0℃时，细胞代谢随温度降低而减慢，对细胞无伤害作用，一旦再置于37℃培养，细胞仍能生长。如温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰而死亡，但如向培养基中加入保护剂（DMSO或甘油），封入安瓿中，即可在液氮中冷冻储存（温度达-196℃），复苏后仍能继续生长。
（四）气体环境和氢离子浓度
气体也是细胞生存必要的条件之一，所需气体主要是O2和CO2.O2参入三羧酸循环，产生能量供细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需要成分，主要与维持培养基的pH值直接有关。大多数培养细胞适宜的pH值为7.2～7.4，低于6.8或高于7.6对细胞不利，甚至导致细胞死亡。对多数细胞来说，耐受酸性较耐受碱性强，在偏酸环境中更利于细胞生长。为维持培养基pH值的稳定，常以CO2/HCO-3和磷酸缓冲液体系来完成。近年来还采用羟乙基哌嗪乙硫黄酸（HEPES），它对细胞无毒，维持pH值在6.8～7.2.
（五）渗透压
大多数细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压为290mOsm/kg，可视为培养细胞的理想渗透压。不同细胞可能有所不同，如鼠细胞为320mOsm/kg，成纤维细胞约250～320mOsm/kg。对绝大多数细胞来说，最适宜渗透压为230～320mOsm/kg。
二、培养细胞的类型与生命期
（一）体外培养细胞的类型
离体培养细胞大多生长在培养容器中，依其是否能贴附在支持物上生长的性质，可分为贴附和悬浮型两大类。
1.贴附型细胞（anchorage-dependant cells， ADC）
大多数细胞在培养时均贴附在支持物上生长，易丧失其原有的细胞外形，依其形态不同可分为以下几种。
（1）成纤维细胞型（fibroblast type）
因细胞形态和成纤维细胞形态相似而得名。细胞呈棱形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不一的突起。细胞借突起而相互连成网状，生长时呈放射状或火焰状走行。除真正成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等均呈本类形态。
（2）上皮细胞型（epithelium cell type）
呈扁平不规则的多角形，中有圆形核。细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜型移动。凡起源于内、外胚层细胞，如皮肤表皮及其衍生物、消化道上皮、肝、胰等均呈上皮型。
（3）游走细胞型（wondering cell type）
在支持物上散落生长，常伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动。
（4）多形细胞型（polyphorphic cell type）
除上述三型外，还有一些组织和细胞，如神经组织细胞等，难以确定其稳定的形态，可统称多形细胞型。
上述分类主要根据细胞的形态和描述上的方便，事实上培养的细胞常随环境变化而改变，如Hela cells（海拉细胞，人子宫颈癌传代细胞）本属上皮型，但在偏酸或偏碱液中可变成棱形，pH适宜时又可以恢复原有形状。
2.悬浮型细胞（anchorage-independant cell， ALC）
此类细胞在培养时不贴附支持物上，而呈悬浮状态生长，胞体呈圆球形，如淋巴细胞等。
（二）培养细胞的生命期
体内细胞常处于动态平衡中，其生存期与机体寿命相一致，培养细胞的生命期则依细胞的性状而定，大多数二倍体（2n）细胞在培养中维持有限生存期，1年左右，传30～50代，相当于150～300个细胞周期，在全生存期中大致经历以下三个阶段。
第I期：即原代或初代培养期。从体内取出组织或细胞首次在体外进行接种培养，称原代或初代培养。其细胞称原代或初代细胞（primary cell）。当原代培养细胞增殖到一定密度后，需分出部分细胞进行再培养，此过程称传代（passage of subculture）。从原代培养直到第一次传代期间称原代培养期，一般持续约l～4周。原代培养细胞呈二倍体核型，与体内细胞性状相似，是较好的实验材料。
第 Ⅱ期：即传代期。原代培养细胞一经传代后即称细胞系（cell line）。此期持续时间最长，细胞增殖旺盛并能维持二倍体核型。呈二倍体核型的细胞系称二倍体细胞系（dipoid cell line）。为保持二倍体细胞性质，细胞宜在原代培养期或传代早期冻存保种。如不冻存则需反复传代而有可能丧失二倍体性质，当传代30～50次后细胞进入第 Ⅲ期。
第 Ⅲ期：即衰退期。细胞虽然生存但增殖缓慢或不增殖，以致细胞衰退死亡。在培养细胞生命期阶段的三期中的任何一点，由于某种原因的影响，细胞可发生自发性转化（spontaneous transformation）或人工诱发转化，使细胞具有持久增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line），无限细胞系的形成以发生在第 Ⅱ期为主，第 Ⅲ期较少。转化后细胞的核型多成异倍体（heteroploid），可能具有恶性化性质。由细胞系分离出来与原系不同的细胞群体称亚系（subline）。
原代细胞或细胞系用一定方法（克隆化）筛选出一个或一群具有某些特征或标记（如稳定的染色体组型，同工酶对病毒的敏感性及生化特性等）的细胞，并在其子代中保持稳定不变者，称细胞株（cell strain）。再次克隆形成的细胞群体称亚株（substrain）。
三、细胞培养的基本方法
随着科学的发展，细胞培养的应用极为广泛，培养的方法和技术不断更新、发展，但基本原理和方法仍大同小异。到底选用何种方法，尚需根据研究目的而定。以下简介几种常用的培养方法。
（一）原代培养
原代培养（primary culture）的细胞周期因其刚刚离体，生物性状与体内相似，是较好的实验材料，也是建立各种细胞系的必经阶段。
1.原代组织块培养法
在严格无菌操作前提下，从供体取出组织（如新生或胚胎的软骨、颅骨、肝、肾、皮肤等），经PBS或Hanks液充分漂洗去除血污后，剪成0.5-1mm3大小碎块，用培养基洗涤后将组织块接种于培养瓶底，并铺匀，组织块间距以0.5cm为宜，每25ml培养瓶可置20～30块。轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，补加含20%小牛血清的培养基，塞紧瓶塞，置于37℃CO2培养箱中2～4h，待组织块牢固附于瓶底后再将瓶轻轻翻正，并继续培养；每周换液2次，经一定时间后细胞自组织块边缘分散出来，称生长晕（outgrowth），最后组织块消失，细胞连成单层，并铺满瓶底时可进行传代。
2.原代消化培养法
在严格无菌操作条件下，取出实体组织如软骨、颅骨、肝、皮肤等剪成小块，经胰酶或EDTA或胶原酶消化后制成细胞悬液，调整所需要的细胞密度，分装入培养瓶中，补足培养基，37℃、5%CO2培养，待细胞长满瓶底后，即可传代。
3.原代细胞培养法
严格无菌操作下，也可直接从供体的体液（如血液、胸、腹腔液）中获取细胞进行原代培养。例如，小鼠腹腔灌洗后所得渗出细胞，常常是实验性巨噬细胞培养的重要细胞来源。
（二）传代培养
来自原代或细胞系或细胞株的细胞经培养增殖后，细胞相互接触而导致细胞扩展运动受阻，称接触抑制（contact inhibition）。此时需进行消化或吹打制成细胞悬液，常规计数后，按1：2或1：3比例分瓶并补足培养基后再培养，称传代。如出现接触抑制后不及时传代则细胞密度进一步增大，最后因营养成分减少，代谢产物增多，发生密度抑制（density inhibition），导致细胞停止分裂。
（三）悬浮培养
悬浮培养时细胞不贴附于支持物内，呈悬浮生长，胞体常呈圆球形。因大多数细胞在体外培养时为贴附生长，欲进行悬浮培养，需用干扰措施，如振荡、旋转等，使细胞在培养中滚动，呈悬浮生长。其优点是代谢产物不致堆积局部，可培养大量细胞，适应用于细胞移植、组织工程学、细胞代谢、细胞动力学及制备生物产品等。
（四）特殊培养方法
近年来细胞生物学发展十分迅速，尤其在与实际结合方面获得了可观的成就，形成了一门新的学科——生物工程学，当前人们已经能够利用培养细胞生产多种单克隆抗体、激素、特殊蛋白质（如生长因子）及疫苗等。同时，组织工程学的发展也促进了大规模或超产量细胞培养法的发展。用一般培养方法所获细胞产量有限，用新的超产培养技术，可获大量细胞。这些特殊培养方法包括球体细胞培养法、微载体培养法、微囊培养法、中空纤维培养法及各种灌流式生物反应器等，培养技术日益成熟并受到普遍重视。
四、细胞的保存与运送
（一）细胞冻存
细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规技术，细胞冻存在液氮中，温度可达-196℃，可长期保存。细胞冻存的基本原理是：在不加保护剂的条件下直接冻存细胞时，细胞内、外环境中水均会形成冰晶，使细胞内发生一系列变化，进而引起细胞死亡。如向细胞中加入保护剂（5%～15%的甘油或DMSO）可使冰点降低，平衡细胞内外的溶质浓度，在慢冻的条件下使细胞内水分在冻结前透出细胞外，防止或减少冰晶形成。
（二）细胞运送
当前培养细胞既可在国内相互寄赠，也可进行国际间的交流。装运细胞有两种方法：一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需特制的容器，又因液氮和干冰蒸发较快，需要空运；另一种方法为充液法，即选择生长良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，并保留少许空间，然后进行装运，此法比较简单。
五、培养细胞生物学性状检测
细胞体外培养过程中，包括初代培养或传代细胞系传代培养时，要逐日进行常规检查，观察细胞有无污染、细胞生长状态、培养液是否需要更新和调整等。一旦培养的细胞通过生长增殖，形态上成为单一的细胞群或细胞系（株）后，需作一系列的细胞生物学检测以了解细胞性状。可根据实验需要确定检测项目，常有以下项目。
（一）形态学方面
1.一般形态观察
可作活细胞相差显微镜观察并摄影。固定观察死细胞常用Giemsa染色，比较快速简便，应用其他染色法亦可。形态学方面主要观察：①细胞类型归属，确认为上皮型亦或为成纤维细胞型等；②细胞的一般形态，如细胞形状、大小、核质比、染色质和核仁大小及多少等。生长状态良好的细胞，透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡，胞膜清晰。培养基上清澈透明，看不到悬浮的细胞和碎片。细胞功能不良时，胞质中常出现空泡、脂液及其他颗粒状物，细胞间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点。只有状态良好的细胞才能用于实验。
2.超微结构观察
超微结构观察有助于比较确切地说明细胞形态特点，如微绒毛的形态、多少、桥粒的有无、微丝微管、核仁的形态和数量的多少及排列状态等。上皮细胞有较多的桥粒。转化细胞做丝、微管排列不整齐，能较特异地说明转化细胞的性状。
（二）细胞增殖生长方面
1.细胞计数法
为测定细胞绝对增长数值常用的最简便方法，一般过程为，接种21孔/24孔板细胞，分7组，培养7天，期间逐日检测一组，计数，逐日检查数值并绘制生长曲线（growth curve），细胞数量增加1倍的时间称倍增时间，亦可从细胞生长曲线中测知。
2.细胞分裂指数（mitotic index）
细胞分裂指数是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数（分裂相细胞数/1000×100%），用以表示细胞增殖旺盛程度。一般要观察和记录群体中1000个细胞中的细胞分裂相数。计算时需用向培养瓶中加盖片培养法，固定染色、制成永久标本后观察。
3.接种存活率（plating efficiency）和克隆形成率（cloning efficiency）
细胞被制成分散的悬液后，以低密度（2～5个细胞/cm2）被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的细胞百分数值称接种存活率，用以表示细胞群的活力。由于检测时是借助观察克隆（通常为16～50个细胞）形成情况，又因每个克隆都来自一个细胞，因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比。
4.MTT测定
MTT测定是一个快速简便的颜色反应测定，哺乳类动物细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的甲酚，用酶联免疫检测仪测定甲低的含量可定量测定细胞的存活比例。
5.培养细胞的同位素
自显术近年来培养细胞同位素自显术除了用来研究细胞的物质代谢外，还可用来分析细胞的动态活动，对细胞周期动力学在细胞生物学和分子生物学的发展方面作出了一定贡献。常见的是分析细胞内DNA、RNA、蛋白质的合成，通常采用3H标记的DNA、14C标记的RNA前体物，14C、35S标记的氨基酸等。
6.流式细胞仪检测
细胞周期时相和DNA合成近年流式细胞术（flow cytometry）的发展已成为检测细胞增殖周期的主要手段，可进行多项检测，如细胞周期时相、DNA合成强度、持续时间等，效果极好，已取代了应用同位素等繁琐方法。培养细胞非常适用于作流式细胞仪的检测对象，程序简单、快速、效果准确。
7.其他性状其他检测
如双层软琼脂培养、浸润生长性检测、异种动物接种致癌性、刀豆球蛋白凝集实验等方法为当前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法。
细胞与生物材料间的相互作用
生物体是由低分子、高分子所组成的细胞、组织、器官和系统等一系列由低级到高级的结构层次构成。人们企图在生物体外面培养生物体固有的细胞或者建株细胞，从中获得某些特殊的细胞生成物。组织工程学中所用支架材料主要是高分子材料，在细胞增殖和特殊的细胞物产生过程中，它们在培养基表面的黏附和伸展情况，是决定能否采用高分子材料作为组织培养基材料的主要条件。
一、细胞与材料的表面特性
生物体内的细胞大体上可以分为两大类。一类如血液细胞，它们各自有独立的功能；另一类是组织细胞，只有在细胞和细胞组合在一起时，才会具有生物功能。细胞和基材表面膜状细胞以外的物质黏结在一起时，也同样具有生物功能。对于第二类细胞，可以采用机械的方式，或者采用酶解的方法，使它们各自处于分散的状态。于是，原来细胞具有的机能便要丧失很多。若采用适当的方法，使分散开的细胞再聚集在一起，并黏附在一种人工基材上，细胞原来具有的生物机能大部分可以再度恢复。
人们已做了大量的工作来研究覆盖在上述细胞表面的细胞膜，探索其功能与结构间的关系。在脂质双分子层内含有称为脂内粒子的各类精蛋白和糖脂质，他们可以在双分子层内转运。大多数情况下，位于细胞膜外部的诸链具有亲水性，并带有负电荷。在细胞膜内侧含有纤维状的内层蛋白质，这类蛋白质一般称之为细胞骨架。糖蛋白和内层蛋白分别具有不同的功能。
高分子一类人工材料的表面结构各不相同，它们是由化学结构不同的大分子聚集在一起形成的，其聚集状态各式各样，从而也就具备了各种形态结构。其表面性质也不一样，有的具有亲水性，有的则具有疏水性，有的会处于极性。水合或带电状态，甚至有的高分子还具有反应活性。
上述这两方面的情况都是非常重要的，因为细胞与高分子材料大都在与生理环境类似的条件下接触，生物体内部存在着大量的媒介质水，以及Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-等离子和许多起源于蛋白质的生物活性物质。但是，细胞和高分子材料表面直接接触的机会不多，而是材料表面以氢键、解离或者在吸附蛋白质的状态下与细胞发生作用。即使高分子本身并不具备某些特定的化学基因，可是，由于材料表面吸附了某种蛋白质以后，材料可能与细胞表面的某些特殊成分相结合，或者相互间发生某种化学反应。
二、细胞与基质材料表面的相互作用
处于单独分离状态的细胞，在适当的介质中和材料表面的相互作用与材料表面性质及细胞类别有关。物理化学作用属于一般的作用，生物化学作用是细胞特有的，一般称之为特殊作用。由生物体产生的细胞，其表面经常处于一种流动的介质环境中，本身要进行正常的新陈代谢和分泌，从而自身会不断地发生变化。
在介质中，处于分散状态的细胞形状为球形，与高分子的表面接触后，会原封不动地黏附在高分子表面，不久细胞变形，在细胞表面出现“伪足”，进而扁平化，细胞形态的这种变化过程一般称为细胞的扩展。在生物体内部的浮游细胞，其膜内粒子和内层蛋白质均匀地分散在细胞内，一旦黏附在材料表面，由于两者间的物理化学作用和生物化学作用，膜内粒子和内层蛋白质要发生重排（形成斑点或帽状物，膜内粒子聚集在一起），于是细胞形态发生变化。黏附在材料表面的细胞形态和细胞膜结构的变化，一般来讲会影响细胞原来具有的生物功能，使细胞功能亢进，并引起细胞活化。
其中PLA、PGA已被美国FDA批准在体内使用，并用来作为医用手术缝线、骨折内固定材料及药物缓释材料。从加工的角度考虑，PLA、PGA类易于通过熔化——注塑技术制成各种形状；而其降解速度则可通过调节共聚单体的比例进行调控。其他几类合成聚合物由于具有良好的生物相容性、可降解吸收性及对细胞的特殊作用，也曾用作细胞载体材料，如聚原酸酯（POE）、聚酸酐。
三、细胞载体材料的成型与加工
组织在体内常为三维空间构型，给细胞的生长提供了适宜的营养条件和空间条件，有利于组织发挥特定的生理功能。因此，植入物的设计应主要考虑载体材料的空间构型、尺寸、孔之间的连通性、材料内部的表面积等。
早期使用的细胞载体材料是采用溶液浇铸法（solvent casting）或压膜法（compression molding）制成的薄膜，由于模具表面凹凸不平，因而膜材表面则留下深浅不一的痕迹。也有采用单丝拉伸法（filament drawing）制成束状单丝或网状圆盘。Robert Langer等最初设计的是聚酸苷小薄片，细胞单层种植在此薄片中进行体外培养，然后再移植到动物身上。但初始实验并不成功，主要原因是细胞的数量和密度与成功植入的要求不相适应。由此提出如何进行多层细胞的体外培养？如何参照自然组织的分支网络结构构建三维网络结构？
目前，细胞载体材料在结构设计、体外培养与体内植入应用得比较成功的有两种结构。
（一）泡沫网状结构
1.单层泡沫
A。 G。Mikos采用盐析法（particulate leaching method）制备出高孔隙率的PLLA、PGA泡沫，其孔隙率最高可达93%。孔的内径可达150μm。泡沫的结构特征与盐的种类无关，但与其用量和粒径大小有关。一般来讲，盐的用量多，孔降率大；盐的粒径大，孔的内径也大。聚合物与盐的最高比例可达1：9，盐的粒径位于100～500μm之间。
采用盐析法制备聚合物泡沫包括以下几个步骤。
（1）将过筛后一定尺寸范围内的盐颗粒（氯化钠、酒石酸钠、柠檬酸钠）加入到PLA的氯仿溶液中，溶液剧烈搅拌成均匀分散体系，在平板玻璃上铺展。
（2）溶剂自然挥发，一定温度下真空干燥。
（3）在PLA熔融温度以上将膜加热一段时间，然后淬冷。
（4）将膜浸入蒸馏水中，不停振动，于25℃每6h换一次水以滤除盐颗粒。
（5）除去盐颗粒之后的多孔泡沫先在室温下干燥，再真空干燥。
对于非晶态的PDLLA制备过程中可以省略第（3）步。
2.多层泡沫
在单层泡沫的基础上，采用层叠技术，将孔隙率为90%的单层泡沫多层重叠，构建出具有精细解剖细胞的三维立体聚合物泡沫。多层泡沫的多孔形态与单层泡沫的孔形态一致，层间相邻孔洞相互连通，并未出现重叠与交叉现象；重叠并不改变泡沫的抗蠕变行为。其中重叠技术包括以下几个步骤：①作出所需植入体的三维立体轮廓图；②由轮廓图制备出高孔隙率的泡沫状薄膜；③层叠出所需立体形状。
采用上述方式制备出的具有一定组织学形状的层叠装置可直接用于重建和矫形外科中，如鼻状层叠泡沫可用于鼻梁缺损的矫形外科修复术中。
总之，采用盐析法和层叠技术可以制备出高孔隙率和具有连通孔结构及形态的三维泡沫状结构，这种方法适用于将生物可降解高分子加工成一定形状的装置以适用于不同细胞的移植。采用计算机模拟组织及器官轮廓图的辅助设计，能够很容易地根据所需要的形状制备出临时支架装置。
L。 E。Freed在PLLA人泡沫装置上进行了软骨细胞的体外培养和体内移植，获得了具有初始形状的三维立体软骨组织，并证实新生组织的组织学表现与正常软骨组织一致。H。L。Wald为了对这种泡沫装置进一步加以研究，设计了染料聚合物微粒模型系列，用该系统对设计装置以及软骨细胞接种注射的外科环境的各种参数进行了模拟研究，初步得到的参数数据，为在软骨细胞的移植中更有效地利用这种泡沫装置提供了理论依据，同时也发现：决定颗粒分布的关键因素是装置孔径的大小。
（二）纤维网状结构
有报道采用聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物PLGA（polylactin
910）纺织制成的纤维束来进行体外软骨细胞的培养，并在体内生成了稳定成熟的均匀软骨板。但PLGA纤维呈无规缠绕状，湿润之后不能保持一定的外形，不利于细胞种植之后的繁殖与生长。W。S。Kim将直径为15μm的PGA纤维浸入含2%浓度的PLLA溶液中，待溶剂挥发即得到PLLA交联的PGA纤维网状结构。交联后提高了网状物结构的内在稳定性，并可防止PGA在实验中过早被吸收。为进一步制备各种精细结构且具有一定机械强度的纤维网状立体结构的支架材料，A。G。Mikos引进了一种复合材料的加工工艺，其工艺如下：
（1）将无纺网状聚合物纤维A浸入聚合物B的溶液中，或将聚合物B的溶液浇注到聚合物纤维A上，其中溶液对A不溶。其次，A与B不能互济，在熔融状态A、B不能共混。
（2）混合物置于空中待溶剂自然挥发，即形成纤维A嵌在B基质中的复合结构。
（3）将复合结构物加热到A的熔融温度以上一定时间，A纤维在交叉点形成熔合点。
（4）选择某种溶剂除去B，即得纤维网状结构。由压汞仪测得上述纤维网状结构孔隙率为81%，表面积/体积之比为0.05μm，这种结构无论其内部孔形态还是机械强度，适合于软骨、肝细胞的种植与移植。
显然，细胞载体材料的内部结构决定着营养物质、气体、代谢产物在细胞与环境之间的交换程度。为便于营养物质的输送、组织的长入及血管的形成，细胞载体材料需高度多孔、孔隙连通、孔均匀分布的网状结构。另外，三维网状结构还必须具有一定的机械强度和内在稳定性。除此之外，设计细胞载体骨架材料的外形还必须避免组织在植入时受到刺激和损伤。
四、细胞载体材料的超结构骨架研究
组织工程是维持组织存在或促进组织生成的应用工程学科。从材料工程角度看，组织工程过多相体系细胞复合材料，包含三个结构成分：功能单元的细胞，细胞外基质，骨架结构。人工组织替代物工程研究重点在于生物材料（用于骨架构造）的结构设计与结构和营养条件的最优化。所谓结构相容性是指结构适于细胞复合物中细胞的生存和复制。其结构中的骨架由确定的结构元素如微孔、纤维或膜等组成，它们可随机分形或周期的组合，当这些结构单元彼此叠加形成复杂构造时，便可称为超结构。
超结构间互相紧密交连以维持材料的刚性，而结构元素的交连性决定了结构的各向异性，如机械性能、开孔分布和细胞间的紧密配合，它还决定了以超结构为骨架的细胞排列顺序。
（一）超结构类型
1.织结物超结构
结织状纤维结构是连锁周线的高度有序排列，连锁的不同方式决定织状纤维的宽度差异，具有不同织状结构，扭曲和纬状交织。单纯的纬织包含左向和右向交联，是最简单的织结结构，它由一根线编织而交联。纤维取向和网孔分布决定纤维的处理、理形和大幅度变形。
2.可注射性
开孔植入体系临床上迫切需要有最小的侵入性手术，外科的做手术技术在手术中应用逐步增加。细胞植入载体体系的多孔结构可能正适合这种需求。新型可注射植入体系，包含可侵入性、植入性和开孔性。其中线状植入材料的一端被引入注射管道内，管道可以是直管或内曲的弯管。载体流体作为植入物的载体，以使其从管道流出直到从球形管道断流。
3.血管极座组织
骨架体系器官替换的一种方法是用骨架把细胞移植上去。通过设计骨架，达到原器官结构的最优化，可以再复制原器官的细胞排列，有助于保留所需的细胞功能。以肝为例，为力求再现天然腺泡结构功能单元，其血管系统的特征是：分支肝动脉遍布于腺泡轴，至其四周并供营养给全部肝细胞，细胞载体装置设计为球形，中间有一开孔以使血管合成具有方向性。这种促使血管生成的装置叫做血管极座。细胞载体的全部内在体积必须是从中部开孔得到的，这使得血管从单个大孔伸出，以维持内在细胞的生存。细胞载体留应有大孔，以供养料和代谢产物内外交换。装置包含中部开孔的中空球，载体内部微孔体系提供了最大的细胞附表面。
4.从两相液体体系
中得到的开孔结构为获得可注射入人体脊椎骨内的骨修复材料，研究了一种包括互不相混的两种液体的两相液体体素。在注入椎间腔几分钟后，一相变硬，另一相作为可吸收的材料形成海绵状的植入物。在手术移走坏死的椎骨后，迅速将该修复材料注射到椎间盘内，并调整开孔度以适应骨的内生长。一般所选择的硬化相是聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥（PMMA），第二相是选几种高黏度或高弹性的水溶性聚合物，如聚乙烯醇（PVA）溶液及聚糖类。这类方法简便易行，不足之处是PMMA的生物相容性欠佳等问题。
（二）超结构骨架的应用
植入物的设计应主要考虑载体材料的空间组织（如骨架孔的尺寸和孔间的交联）是否便于血管的生成和植入细胞的存活。植入物的生物稳定性还取决于下列因素：强度、黏弹性、材料界面的可吸收性和降解性。下面分别介绍各种骨架结构的应用情况。
织状纤维的孔隙度有两类：不同层间的空间尺寸和周边内的小孔尺寸，都应大于供血管生成和组织内生长的适宜尺寸。从其结构看，织状纤维结构具有形成三维空间结构的能力，它能作为管状或片状等的支持类型，从而再现原组织的结构，在损害性血管的治疗中，织结在伤口愈合期还起支撑网络的作用。
组织工程中的可注射性开孔植入物的潜在用途是两方面的：一方面被用作诱导组织生成或再复制的骨架；另一方面可用作包裹在线状材料内的细胞支撑装置。这两种情况都充分发挥了最小侵入性植入技术的优势，在任何注射直管、弯管可达到的部位，这类植入都是可行的，植入物还可以注射到人体内的软组织和空腔中去，植入物尺寸和形状可以根据注射部位进行调整。
血管组织骨架材料主要采用的是氧化铝，这种材料呈化学惰性，因而具有生物固定性。其他生物相容性陶瓷材料如磷酸钙类也可采用与Al2O3同样的加工方式制成同样的形状使用。
组织工程学的应用现状与前景
应用组织工程学的原理构建的杂化人工器官除在临床上应用外，还可作为在体外研究复杂的组织功能的形态形成的工具。有代表性的组织工程应用说明如下。
一、软骨细胞
软骨细胞作为组织工程第一种获得成功培养的组织，给未来组织及器官移植和重建带来了无限的发展前景。在Kim及Vacanti等的实验方法中（1999年），他们应用特制的生物降解性能良好的PGA纤维（直径为15mm），编织成四种形态不同的支架（三角形、矩形、十字形和圆柱形）。先将这些纤维织物浸泡于加有2%L型聚乳酸（PI， LA）的一氯甲醇液（methylchloride）中约2min，然后取出任其蒸发，晾干后成型，并使聚乳酸纤维黏附于PGA纤维中而产生黏固作用，最后剪成上述几种形态。电镜测定这种聚合物的厚度为0.6～0.1mm。
在新生小牛的软骨关节表面采集软骨细胞，游离细胞混合液的浓度为5×107个/cm3.将软骨细胞放入培养皿中，每一个支架上种植10pI软骨细胞混悬液，放入特殊配方的培养基中进行细胞培养。一周后将此支架埋植于裸鼠皮下组织中。结果在3、6、9、12周后所有36支标本均已被新生软骨细胞所包围，和原有形态完全相同。10只圆柱状标本亦为软骨所替代。电镜检查可以见到新生软骨的周围部分较中间部分较少组织生成和成熟。3周后聚合体即开始降解，一直持续到12周。免疫组织化学检查显示标记有Brd—u的细胞出现于新生软骨腔隙中，表明所种植的软骨细胞至少部分地产生了新生软骨。
值得指出的是这种细胞增生只限于载体的范围内，不超过聚合体外周几个毫米。而种植支架材料在pH值、血管化程度、局部组织酶和脂质浓度等方面均较天然物质如胶原为佳。实验更证明，胎牛软骨的透明细胞和成年牛的软骨细胞相比较，前者具有更强的繁殖能力。
另有实验显示，应用组织工程产生的软骨不但可以修复体内软骨缺损，而且还可以应用于颅骨缺损的修复。在动物颅骨上截除全层颅骨及骨膜，应用软骨细胞-聚合体和骨母细胞-聚合体分别充填骨干缺损部，3、6、9、12周后检查显示，3周后均已有软骨细胞组织充填，2种标本基本相同。6周时的标本中，种植骨膜细胞者，显示新生软骨细胞已开始骨化，而种植软骨细胞者仍是软骨状态。9～12周标本，植入软骨细胞部位仍见到软骨组织，而种植骨膜细胞者则已被新生骨组织所替代。这说明在骨骼形成过程中，可见到软骨形成的过渡形态，而软骨细胞最终仍不能出现骨化。
二、骨骼的组织工程
骨骼组织的重建，目前仍存在不少问题。自体植骨固然最佳，但来源有限，且可能在供处造成继发性损伤并发症。在塑形方面亦存在缺点，异体植骨仍然存在免疫排异、储存和并发症等问题，而异种植骨则存在更多问题。各种有机物或无机骨骼替代品的单独使用，或（和）脱钙的自体骨合并应用亦在研究中。最近Ono等将骨细胞移植于同种异体赋形材料上以产生新骨组织已被成功地应用。其他新的合成材料也正在寻找中。但迄今未能找出一种完美理想的代用品。在这种情况下，应用组织工程技术以产生骨骼组织便应运而生，并成为非常有前途的研究课题。Vacanti（1993年）等将小牛骨膜细胞种植于多层编织的聚羟基乙酸（PGA）支架中，然后移植于裸鼠体内，实验结果证实骨细胞可以增殖而成为骨骼，观察其成骨过程，在最初几星期中，先出现软骨形成，最后才成熟而形成新的骨骼，这就是上述的软骨化成骨过程。这种成骨过程的速度与局部的血液循环是否丰富有关。另一实验是将软骨和骨膜细胞合并移植，将两种细胞分别种植于载体中，然后缝合在一起，埋植于动物体内，随着时间的推移，证明种植骨细胞的动物只形成骨骼组织，而种植软骨细胞的动物仅能产生软骨。二者之间出现截然的听骨-软骨结合面（interface），这种现象可以用“软骨细胞能分泌一种血管抑制因子，可阻止血管长入，而不导致形成骨骼组织”的理论来解释。
应用显微外科技术进行带血管蒂骨组织移植的优点早已在临床上得到证实而被广泛采用，但采用范围毕竟有限。现在研究人员正在设计应用组织工程技术来进行血管化的骨骼再生。方法是将成骨细胞种植于预制带血管带的生物降解载体材料上，将它作为一种细胞传送装置。实验过程中，将新生胎牛的骨膜细胞种植于聚合物支架上。在动物体内培养2周后，再移植于小白鼠的右股动脉部位。6～9周后进行尸检，6周时见有软骨组织形成，包围于骨化小岛4周，最后在12个标本中，有10个显示新骨形成；骨化程度及骨形成密度均随时间推移、血管长入而增加；最终在血管蒂旁形成了有机骨小梁的新生骨骼组织，这就为将来在临床上将此血管蒂的骨骼作为新的骨移植材料提供了科研依据。
三、肌腱的组织工程
肌腱移植是临床上经常应用的一项技术，但自体肌腱来源有限，且它是通过爬行置换的过程而形成，已非原来的肌腱。异体肌腱亦有应用，但存在排异和感染的可能。在20世纪70～80年代各种人工代用品已被试用，如用碳纤维作为支架，它可以在体内最终被纤维组织所替换，而发挥肌腱或韧带功能，但碳分子并不最终消失，甚至几年后可能出现于局部淋巴结中，故现已废用。近年来，由Dacron诱导生成的纤维组织十分近似疤痕或肉芽组织，但可引起炎性异物反应。胶原性肌腱代用品亦被试用过，但已证明它可被受体成纤维细胞侵入，而导致吸收。因此，应用组织工程再生肌腱目前亦已成为研究目标之一。
曹谊林、Vacanti等，将小牛肩、膝部的肌腱切下后，剪成0.5cm大小块状物，放入50ml含磷酸盐的缓冲剂（phosphate buffered）的生理盐水中，清洗2次，用酶消化12h，以获得游离的肌腱细胞；然后植入0.4cm×0.4cm索条状未编织的PGA网状支架上；细胞密度为15×106个/ml，在37℃、CO25%的条件下培养1周；然后植入小鼠的皮下组织层，于3、6、8、12周后进行尸解。从外观上、组织学和生物力学三方面进行检查，结果在6周标本中，在支架四周均显示排列着拉长的肌腱细胞，埋置于胶原纤维中，但在中心部分则显示较多的随意排列的肌腱细胞和细胞间支架结构。在12周标本中从四周和中心部分已完全和正常肌腱细胞相同。在采用纵形结构的PGA载体中，则在6周就出现平行排列的肌腱细胞，它较任意排列的网状标本更加整齐一致。
生物力学测定，存在有直线方向的牵拉应力，它随时间增加而增加。8周时达到相同直径之新鲜小牛肌腱拉力的30%，12周时达到57%。实验中还发现肌腱细胞极易和各种聚合物相黏附，和未编织的PGA网状体似有更大接触力。宜接纵形的植入物，可更早地生长平行排列的新生肌腱细胞。显然，如时间较长，最终都可以产生同样形式的肌腱特殊结构形态。上述实验证明，如组织结构愈近正常，则新生肌腱具有更坚强的牵拉应力。
四、肌肉的组织工程
如能够应用组织工程进行肌肉组织的再生和重建，则将在治疗肌肉损伤、瘫痪等方面带来极大的临床效应，例如对心肌、肠、泌尿系统平滑肌的修复，对肌肉萎缩症的治疗等，有划时代的意义。现在应用药物来治疗上述许多疾病，仍存在许多困难和问题。目前，应用基因治疗和细胞基（cell based）治疗已可以治疗杜兴肌肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy， DMD），它是将健康亲属采集得到的主肌母细胞移植于病人，使患者产生一种Dystrophin的物质，1～6个月后可以产生良好的治疗作用，但效率仍然很低。肌母细胞也可以从一个健康部位转移接种到另一部位，这也可能是治疗DMD和其他肌萎缩症的另一种途径。
骨骼肌肉具有较强的再生能力，而对于心脏病患者来说，人们普遍认为心脏肌肉一旦损害就很难再生。这可能是由于前者具有卫星细胞（satellite cells）而具有再生能力之故。最近，有人采用自体骨骼肌的卫星细胞移植于心肌损害部分，在大体实验上已证明8周后可形成新生心肌，但在12周后又消失，故仅在初试阶段。
五、皮肤的组织工程
严重烧伤是一种多发性创伤，我国的发生率亦较高。虽然，我国的烧伤临床治疗已跃居世界先进水平，但在三度烧伤的皮肤修复研究方面，和国外水平相比，仍存在一些距离和问题，其关键仍然是自体皮片的来源有限，须寻觅其他人工代用物。故此，应用组织工程技术在体外进行上皮细胞培养，或制成一种复合的表皮、真皮的人工皮肤，是一个极为迫切的研究课题。大规模上皮细胞培养繁殖始于1975年（Rheinwald），后来又经一些学者进行探索（Green，1979；Gallico，1984；Campton，1989等），上皮细胞培养已先后应用于临床病例，获得初步成功，但创面上成活后的上皮组织仍然存在弹性欠佳、耐磨性差、柔软度不足等缺点，故难以推广。Bell等（1981，1983年）先后将新生儿包皮细胞和真皮的成纤维细胞与牛L型胶原制成的ECM，上面附以人体表皮细胞生成人工皮肤，并证明可为人体创面所接受。Yannas等（1982年）则应用一种可以防止体液丧失的健胶膜，在其底层加上由硫酸软骨素和胶原合成的材料作为一种人工皮肤移植于烧伤创面，它可以诱导血管长入和向内产生新的结缔组织；3周后再在其表面移植L层菲薄的表皮皮片，经临床应用证明可以得到较好的疗效和产生新生疤痕组织。
Green等（1979，1992年）实验是将表皮细胞先在体外做培养，1cm2的表皮组织可以增加到10000倍（等于一个成年人的体表面积）。方法是将角质层细胞在一层可供给营养物质的、经放射处理的NIH/3T成纤维细胞上进行培养，可以得到细胞的快速增殖。这种方法可望用来治疗大面积皮肤烧伤创面，但它的缺点则是这种培养方法约需3～4周时间，这对严重烧伤病人来说，可能带来不利，但如同时应用干燥冷冻异体皮肤移植将有助于克服这个缺点。
另一种颇有希望发展的是应用人类胎儿的真皮成纤维细胞，在具有降解性的PGA织网上进行培养。由于成纤维细胞易于冷冻保存和生长，故可望得到均匀的细胞群。在治疗包括全层皮肤组织在内的深部创伤时，可先将此种细胞移植于创面上，然后再在上面移植上皮细胞。这种移植组织可望有充分的血管网形成，最终形成一层极似真皮层的机化组织。临床试用已证明有极好的耐受性和未见排斥反应（Hansborough，1992年）。美国市场上已出售一种异体干燥冷冻真皮组织（商品名为Alloderm），可移植入人体无菌创面上，再在其上移植自体薄层上皮细胞，可望得到表面理想皮质柔软的移植效果。但售价昂贵，一时难以推广。最新的文献报道是Valle等（1996年）进行的实验报告。为了克服上皮细胞培养后移植的一些缺点，他们发展了一种双层皮肤细胞（HSE， human bilayered skin equivalent）。他们的设想和Hansborough
等的实验大致相似，是在表皮细胞层下方加上一层真皮结构，但他们使用的是胶原和人体活细胞组成的三维结构的双层皮肤代用品（SE）。临床应用结果证明，这种皮肤代用品，优于单纯应用的上皮细胞培养繁殖片。我国复合人工皮的研究和制作亦已开展，第三军医大学王旭等（1997年）应用新鲜尸体皮肤制成大片的真皮组织。用乙酸提取胶原，经NaCl盐析纯化、冷冻干燥，制成固体胶原膜，并在其两面分别种植表皮细胞和成纤维细胞，培养后种植入受伤创面。他们在10名病例中试用，成活7例。随访1年，获得满意疗效。
六、组织工程技术的前景展望
组织工程是目前医学科学、材料科学、工程学新发展的前沿学科，它涉及这些领域的多个方面，特别是基础学科方面的深入研究和探索。而对于临床学科来说，其发展前途尤其令人鼓舞，它将改变人们对组织和器官移植的老观念，进入修复重建和再造的崭新领域，将使医学临床治疗学产生一个革命性的发展。
在细胞载体材料的研究方面，一方面除需对现有材料的表面形态、空间结构进行进一步的改善和深入研究外，还必须谋求更新和更有效的生物材料作为载体，更适用和可靠地进行各类不同细胞的繁殖和种植技术。同时，在进行支架结构的构建中，利用先进的计算机技术和工程学原理，构建出适合植入体所需的三级立体轮廓图和适合于细胞黏附、生长繁殖和代谢的内部网络结构，这也对生物材料的成型与加工提出了更高的要求。
在基础医学方面，首先必须在细胞生物学中进行深入研究，例如，细胞生长是如何被控制的？细胞外结构成分又是如何影响细胞的本身功能的？免疫学和细胞遗传学在细胞种植过程中的可能作用和在基因治疗中的联系等。采集组织细胞的来源问题、保存问题和细胞老化问题是另一个重要方面。种植的细胞可以来自自体组织、他人组织或动物供体或自体及动物的胚胎。选择细胞来源时同时也存在着医德、安全和效果方面的伦理问题。冷却技术已成功地应用于保存某些细胞，但尚需扩大领域，以便最终建立细胞库和组织库。大规模的细胞培养系统的建立也十分重要，以保证细胞在移植前的营养供应问题。此外，培养和保存过程中的灭菌问题也同样重要。
在临床应用方面，软骨细胞的组织培养技术已达到成熟阶段，可望在不久的将来应用于临床。一旦成功，将给整复外科耳再造等手术带来革命性的改进，促进整形、移植技术发生观念性的改变，而进一步促进骨骼、气管的组织工程，肝、胰、肾等细胞和器官以及神经和角膜等组织的动物实验及临床应用的发展；也将使组织工程这门新学科，和20世纪60年代开始发展萌芽的显微外科一样，由整形外科开始，迅速波及临床医学各学科，向传统医学技术发起一场新的挑战，从而掀起一场医学革新浪潮。
目前，国内组织工程的研究还在开始阶段，已有少数单位开始从事此项新技术，如辽宁省人民医院、北京大学第三医院整形外科和华西医科大学骨科等。后者已由杨志明等开始对兔自肌腱细胞与碳纤维联合培养及体内植入的实验研究，将它桥接肌腱断端，观察到肌腱细胞具有增殖和合成胶原的能力，术后4周观察到植入物间胶原纤维组织趋于致密组织结构，有大部分胶原纤维已连接断裂部。此为肌腱内源性愈合提供了进一步实验的依据。上海第九人民医院整复外科已建立了上海市组织工程重点实验室，由Vacanti的助手曹谊林，在美国期间应用组织工程技术进行人型耳郭模型再造研究的基础上，继续研究，扩大成果，拟在临床上开始进行人体软骨细胞种植，为开创组织工程的临床应用作出贡献。
同济医科大学附属协和医院骨科将组织工程学与分子生物学有机结合，将基因修饰的种子细胞移植修复骨、软骨缺损也取得良好效果，并在国际上首次提出“分子组织工程学”这一新概念，对其定义、学科地位、必要性、可行性、现实性、应用前景和对组织工程学的影响等问题，进行了多层次、多角度的论证，在首届全国组织工程学术交流会上引起强烈反响。它们认为二分子组织工程学是将分子生物学与组织工程学有机结合，运用分子生物学的理论和技术，从分子水平研究细胞、组织诱导因子、生物材料及其相互作用的关系，为研制能更有效地恢复、维持或改善病损组织功能的生物替代物奠定基础。它作为组织工程学的一个新兴分支学科，代表着组织工程学研究的新领域和重要方向，支撑着21世纪的组织工程学，使其加入到现代生物医学革命的前列，进而推动生命科学和工程学的进步，为根本解决在20世纪末困扰医学界的主要疾病（组织缺损或器官衰竭）创造条件，造福于人类。
（贺海怿；汤立新；张春霖；娄朝晖）
§§第二篇 现代骨科生物材料
