第一节 动物交配及妊娠判别方法
一、动物的选择
（一）种属
理想中的生殖实验动物最好能满足以下条件：价格低廉、容易操作、受精率高、易于繁殖、产仔多、妊娠期短、易确定交配时间，自然死亡率和流产率低、检查胎仔方便、对受试品反应敏感、代谢过程和胎盘的结构及功能尽可能与人一致、获取的有效信息量大。至今，尚未发现有一种动物完全具备上述条件，也无一种动物模型对发育的反应与人类完全相同。因此，选择实验动物品种或种属，应具体问题具体考虑，抓住需要解决的主要问题，兼顾其他。
（二）常用动物
1.小鼠孕期短而一致，产仔多，对致敏作用敏感，自发畸形率较低。交配率和受孕率较高。但小鼠的早期胎盘与人相差较大，是卵黄囊胚胎，这种胎盘类型和功能的差别可能对实验结果产生影响，出现假阳性或假阴性结果。
2.大鼠具有小鼠同样的优点。缺点是对致畸作用有较大的耐受性，实验结果易出现假阴性。早期是卵黄囊胚胎，也可能出现假阳性。
3.兔其胎盘结构与人较接近，能更好地反映人体情况。但兔是草食动物，消化功能与人不同，不适合经口染毒。自发畸形率较高，孕期不一致。
人类以外的灵长类动物，种系上最接近人类，实验结果与人存在良好的一致性。但此类动物来源困难，不易管理，价格昂贵，实验周期长，故应用上存在很大的局限性。
实验应选用性成熟的未交配过的健康动物进行。雌性小鼠生育年龄为50～60天，体重20～30g。雄性小鼠生育年龄为60天，体重20～35g。雌性大鼠生育年龄100天，体重200g。雄性大鼠生育年龄为100天，体重300g。雌兔生育年龄5～6个月，体重4.5kg。雄兔生育年龄为6～7个月，体重4kg。一般选用较大体重的动物进行交配比较容易受孕。
二、动物交配方法
（一）自然交配
1.啮齿类动物将大鼠或小鼠按雌：雄为2：1或1：1的比例，每天下午同笼，次日晨取出雄鼠，以4天或5天为一个周期（大鼠性周期为4～5天，小鼠性周期为4天）进行交配。
小鼠性成熟时期的标志：母鼠阴道打开，阴道开放后出现求偶周期，有交配的欲望，乐意接近雄鼠；雄鼠睾丸下降，精子生成。为提高交配的成功率，必要时可用Whixtten法对雌鼠进行“预接触”，在交配前2天，将一只雄鼠放入5cm×4cm×4cm的封闭的栅栏筐，把鼠放在装有10只雌鼠的笼内。雄鼠和雌鼠一起生活2夜，第3天晚上，放出雄鼠，与雌鼠开始交配。经上述“预接触”后的雌鼠，30%～40%可查见阴道栓。
交配在下午4：00时左右开始，雌雄2：1或1：1，关在同一笼子里，最老的雌鼠先交配，根据需要确定交配的雌鼠数，当同一批的雌鼠交配结束后，雄鼠与下一批雌鼠交配。
2.兔
（1）交配健康性成熟的兔每月发情2次，每次持续3～5天。在发情期中，雌兔出现某些性情变化，例如，追逐骑跨等行为，外阴部出现黏膜水肿，变红或变紫，这时适合交配。交配时将雌兔、雄兔从笼中取出，放在同一笼子里，在雌兔与一只雄兔交配完后，接着与另一只雄兔交配或在第一次交配后相隔10～12h再与另一只雄兔交配，复交可提高雌兔的受孕率。复交后的雌兔称重，记录交配日期和雌兔号。
（2）家兔交配注意事项①病兔或体弱兔不宜用于实验；②正在换毛时体质较弱者不宜交配；③性未成熟兔不宜交配；④过肥或过瘦的兔不宜使用。
（二）人工授精技术
1.授精前的准备小鼠或大鼠一般不采用人工授精方法。兔多采用，人工授精法准确性高，方法可靠，可提高兔的受孕率。兔人工授精技术需要的设备和物品如下：①人工阴道和套管（1号乳胶导管）；②精液采集管（内径13～14mm的离心管切断至5cm长）；③K-Y胶状物；④显微镜、消毒器、授精管；⑤黄体激素；⑥1ml注射器、6号注射针头；⑦血球计数器、隔离衣；⑧血液稀释吸管（红细胞）、吸入装置；⑨0.9%生理盐水；⑩家兔。
2.雄兔精液的采集用左手将收集管放入人工阴道内，用K-Y胶状液润滑人工阴道，将左臂弯曲使兔的头部放在左臂上骑跨一条腿，用右手抓住兔的颈背部，左手持人工阴道放在后腿之间戏逗。一般不超过1min雄兔即可射出精子，这时停止戏逗，回收小瓶，取出凝胶，将标本放入烘箱，直到能进行精子计数为止，立即进行精子计数。如果发现精子中含有血液或尿液时，此标本不能使用。好的标本为乳白色，清亮或稀薄的颜色少见。
3.采集精液注意事项
（1）采集精液的雄兔一般应在8个月龄以上。每周采集3次，每次1ml。精子的计数与总量应无明显减少。
（2）采集精液前准备好所需设备，用肥皂水和清水彻底清洗，75%乙醇消毒血液吸量管和授精管，晾干。
（3）人工阴道套管和采集管用于采集精液，套管是活动的，用橡皮筋捆在精液采集管的下半部，放入人工阴道内，人工阴道的套管的上半部加K-Y胶状物，用皮筋加固套管，人工阴道内的大小和胶状物必须合适，人工阴道太小可引起雄性损伤或引起疼痛使雄性受惊。
（4）采集精液前，人工阴道、生理盐水、精液吸量管和采集管在烘箱内加热到50℃，30～40min，人工阴道的温度为40～50℃，温度太高将引起精子损伤，同时也会引起雄性排尿，造成尿液对精子的污染。
4.雌兔人工授精方法用一根干净温暖的人工授精管，管内吸取0.25ml精液，操作者取坐姿，将雌兔放在两膝之间，抓住雌兔颈背部，臀部皮肤放松，使兔背向人，用另一只手抓住雌兔后腿，将尾巴向外拉起，暴露出外生殖器，用授精管的尖角插入阴道内，深度为授精管的1/4，当感觉有阻力时（可能在骨盆边缘），180°缓慢转动并继续插入8～10cm，加压活塞注入精液，用插入的同样方式缓慢退出授精管，放下兔尾，如果在授精中雌鼠排尿，应重做，每只雌兔人工授精需15～30min。授精的当天被认为时第0天，在妊娠30天处死。
5.人工授精注意事项
（1）雌兔人工授精前，经耳缘静脉注入黄体激素1ml/kg，体积0.2ml/kg，以促进排卵，注射黄体激素后2h内进行人工授精。
（2）每只雌兔给精液量为0.25ml，人工授精管的插入与拔出时注意操作要轻柔，以免损伤兔的阴道黏膜。
三、妊娠动物的判别
（一）阴道分泌物涂片检查
雌鼠在正常情况下，每隔4天为一个性周期，一般发情后2～3天即可排卵。分娩后24h可受孕，这些变化是受卵巢功能所控制的。卵巢能分泌2类激素，一类是由卵巢颗粒细胞分泌的雌激素，另一类是由黄体细胞分泌的孕激素。雌激素的主要功能是刺激副性器官和乳腺的生长。动物在成年时期副性器官的发育、成熟和副性征的出现，以及在性周期内子宫内膜和阴道黏膜增生性的变化都依赖于雌激素的作用。小鼠发情期是雌激素分泌最旺盛时期，孕激素是子宫进行正常功能的主要激素。
1.动情周期的判别用显微镜观察阴道液涂片可推知动情周期（4～5天）处于哪一阶段。阴道液涂片的细胞学变化与昼夜周期有关。动情周期受中枢神经系统、情绪和脑垂体前叶控制。啮齿类动情周期依细胞学变化可分为以下几个时期。
（1）动情前期生殖道内组成代谢活动增强，子宫充血肿胀，阴道口张开。阴道涂片中可见大量有核细胞和一些角化上皮细胞。此期持续时间约12h。
（2）动情期生殖道内组成代谢活动增强，外阴肿胀或充血，阴道口张开，阴道涂片可见大量有核细胞和角化上皮细胞，细胞分散，未成团成堆。此期持续时间约12h。
（3）动情间期缓慢生长的静止期，阴道涂片见大量白细胞。此期约持续57h。
交配一般在动情前期的晚期或动情期的早期发生，这段时间持续较短（总共约24h），动情间期占整个4～5天周期的绝大部分。
2.阴道涂片的制取制取阴道涂片最好用一个小点滴管，用火焰将头部烧光滑，口径缩小。用点滴管吸几滴生理盐水，滴入阴道后再吸回，将滴管中的阴道冲洗液滴在载玻片上，空气干燥，盖上盖玻片，制成标本。可加点甲苯胺蓝以提高反差，使细胞核清晰易辨。在低倍镜下（40×）观察细胞的类型，然后换成高倍（400×）镜，细胞可能是有核细胞、角化（老的、无核的）上皮细胞或白细胞。有核上皮细胞通常呈卵圆形或多角形，有容易着色的明显的细胞核，角化上皮细胞非常薄，有许多皱褶，可通过适当的染色加以识别。接近动情期时可能有一些黏液。观察阴道涂片的组织学变化，可确定动情周期的不同阶段。
在生殖或发育实验时，交配期没查到阴道栓（小鼠），或阴道涂片中未见到精子（大鼠）的雌鼠，一般需进行阴道黏膜细胞学检查。因为大鼠和小鼠的动情周期4～5天，在交配期没查到交配证据的雌鼠，可通过连续5天每天查阴道涂片，以确定动情周期是否正常。根据每天观察到的细胞主要类型，判断动物处于动情周期的哪一阶段。
（二）阴道栓检查
1.小鼠小鼠在交配后，于母鼠的阴道口形成一种白色的阴道栓，这种阴道栓的形成是因雄鼠的精液、雌鼠的阴道分泌物相混与阴道上皮等遇空气迅速变硬，将阴道口封闭的结果。阴道栓一般在交配后12～24h自动脱落。由于小鼠交配后能产生这种特殊的阴道栓，所以常把检查阴道栓的有无作为判断是否交配的重要标志。
交配后次日清晨，尽可能早地检查雌鼠有无阴道栓，如阴道栓不易见到，需做深部检查，用一把眼科镊轻轻插入阴道，撑开阴道口，观察有无阴道栓。未查到阴道栓的雌鼠放回繁殖群，查见阴道栓之日定为妊娠第0天。妊娠第0天时，将阴道栓阳性的雌鼠关在一起，每笼最多5只，放在实验室饲养。记录小鼠的请领日期、编号、孕第0天体重、雄鼠编号和研究编码，每只交配成功的雄鼠也应做好记录。
2.大鼠大鼠阴道栓一般在交配后2～8天自行脱落，故次日晨检查时，在阴道内不易查见阴道栓，应查笼底盘内有无脱落的阴道栓。
（三）家兔妊娠诊断
家兔妊娠诊断一般用拇指和其余四指轻轻按子宫部位进行摸胎，在交配后第10天，胎仔如黄豆大，第15天如白果大，第20天如胡桃大。能够确定是否受孕的最早时间是在交配后第12天左右。假孕的诊断可用摸胎法诊断，也可观察早期拉毛做窝现象进行判断（一般交配后15天左右开始拉毛）。
（四）亲代雄鼠精子活动度和精子计数分析
1.精子活动度判定
（1）取一侧附睾迅速称重后，置于1ml精子营养液中，剪碎附睾，在37℃下孵育15～20min，然后取少许精子悬液，充入血细胞计数池，在25～30℃条件下，用高倍镜观察精子活动度。同时按照精子泳动状态将其分为4级。Ⅰ活动力良好：精子活动良好，呈直线游动；Ⅱ活动力一般：精子活动比较活泼；Ⅲ活动不良：精子运动迟缓，原地打转；Ⅳ死精子：有精子形态，但无活动力。
（2）取200个精子，计算精子活动率。整个过程在10min内完成。最后，将血细胞计数板加热（60～80℃）数秒钟，处死精子，用与红细胞计数相同的方法，进行精子计数，然后根据每只附睾的重量和稀释倍数，求出每10ml附睾所含的精子数（百万）。
2.亲代雄鼠精子形态学试验取一侧附睾置于1ml 生理盐水中，剪碎，用4层擦镜纸过滤后，做精子悬液涂片、空气干燥、甲醛固定。用1%伊红染色1h，自来水淋洗，干燥后在高倍镜下观察精子形态，每鼠计数1000个精子，计算畸形精子的百分率。畸形精子包括无定性、无钩、香蕉形、胖头、双头、尾折叠、双尾等类型。
（五）胎仔检查
1.吸收胎、死胎和活胎检查
（1）吸收胎
着床腺：新鲜子宫经硫化胺染色后才能见到的子宫内壁上的微小突起。
早期吸收：仅有子宫腺、胎盘母体部及胎盘胎仔部存在。
中期吸收：除上述组织外，还有一些胎仔组织。
晚期吸收：有可辨别的胎芽存在。
F吸收：死亡胚胎，有清楚可辨的指（趾），体重＜0.3g。
（2）死胎死亡胚胎，有清楚可辨的指（趾），体重＞0.3g。按胎鼠在子宫中的位置给胎鼠编号。
（3）活胎可观察到胎鼠心跳和（或）运动。按胎鼠在子宫内的位置给胎鼠编号。
2.胎仔外观检查用放大镜对每一个胎鼠进行外观检查，首先检查身体是否匀称，有无血肿和疝，头盖骨有无异常隆起或凹陷，脑脊膜、脊髓或脑有无突起。检查头部性状有无异常，眼、耳、鼻、口的形状、位置及大小是否正常，上、下颌大小是否正常，有无唇裂。然后用一把镊子从上下颌间伸入口中，压下舌，观察舌、腭有无异常。观察眼的大小（小眼或大眼），检查有无突眼、开眼或无眼等。四肢检查包括大小、形状、位置及趾（指）的数目、分离情况等。接着检查肛门、外生殖器和尾，注意有无肛门闭锁及位置异常。观察外生殖器的形状及大小，尾的长度及有无卷曲。
3.胎仔性别鉴定小鼠胎仔性别的区分，主要以生殖器（阴茎或阴户）与肛门之间的间距长短及肛殖之间有无被毛作为标志。主要区别如下：①雄鼠的生殖器突起，并较雌鼠大；②雄鼠的生殖器距肛门较远；③雌鼠肛门和生殖器之间有一无毛小沟；④雄鼠在肛门和生殖器之间长毛。胎鼠性别的确定，也可采用下腹部切口，暴露卵巢或睾丸的方法。
家兔胎仔性别鉴定主要是根据动物肛门与生殖器之间的距离来区分，距离远的为雄性，距离近的为雌性，主要区别如下：①雄兔的生殖器突起较雌鼠明显；②雄兔的生殖器距肛门较远；③雄兔的乳头不明显，雌兔有8～12个乳头，很明显；④对于刚开眼的仔兔，在检查性别时，可用食、中指夹住尾巴，用拇指轻轻向上推开生殖器，局部呈“（）”形，下为圆柱体者为雄兔，局部呈“Y”形，下端裂缝及于肛门者为雌兔。
4.胎仔的头部检查胎仔的头至少在Bouin液中固定48h后再进行检查。检查时头部置于蜡板上，用立体显微镜验证在外观检查时发现的畸形。记录所见外观异常，用解剖刀或单面刀片将刀切5刀，分成6个端面，检查头的内部结构，记录所见畸形。遇到血肿、肿块、凹陷等应在其上再切一刀，以便查明引起这些异常的原因。
第1刀，暴露舌、腭、上唇和下颌，这一刀从腹侧至背侧（即水平切面），由嘴开始，经两耳切开。切除舌后，检查腭和上唇是否完全闭合（腭裂和唇裂）。然后将头翻转，前背后向上，准备切另外4刀（额切面）。
第2刀，由双眼前方轻轻下切。暴露鼻中隔、鼻窦和腭的横切面，记录鼻窦的形状及异常闭合。
第3刀，由双眼切下，暴露大脑的嗅叶、鼻中隔后部大部、鼻窦（鼻咽腔）和腭。胎仔的眼由视杯、视网膜、玻璃体、晶状体和角膜组成。除去玻璃体腔，检查卷曲的视网膜。检查上述排列是否正常。
第4刀，由双眼后面切下，暴露大脑半球和侧脑室（第Ⅰ和第Ⅱ脑室），注意观察这些脑室有无异常的缩小或扩张（脑积水）。
第5刀，暴露位于间脑的第Ⅲ脑室，第Ⅲ脑室的 侧和背侧通过室间孔与大脑半球内侧脑室相连，尾侧通过大脑导水管与第Ⅳ脑室相连。注意检查第Ⅲ脑室有无缩小或扩张。
胎仔头部畸形，除腭裂和开眼外，其他各种畸形的头部切片均分别储存在含有Bouin液的小瓶中，注明研究编号、处死日期、母体号、胎仔号、畸形种类等。
5.胎仔的内脏检查取每窝1/2或1/3活胎，放入Bouin液固定2周，2周后取出胎仔，自来水冲去Bouin液，用单面刀片进行切片检查。检查时将胎仔放在腊板或木板上，剪去四肢和尾，左手固定胎鼠，右手持刀片从头部逐一向下做横切片，共切11～12片。
非固定胎仔内脏检查首先从胸腔开始观察，胸腔检查胸腺、肺、心包和心脏、气管。腹腔内脏检查计数肝叶，检查斑点及融合、质地和颜色是否正常，检查胆囊、胆管、胃、脾、胰和幽门括约肌，注意观察大肠和小肠有无变异。
第二节 动物的去势及剖腹产技术
一、动物的去势方法
实验动物的去势是指通过人为的方法摘除或破坏实验动物的生殖腺及其附属器官而使之绝育的方法。
（一）睾丸切除术
睾丸切除术是指切除雄性动物的睾丸，常用于雄性动物的去势。
1.大鼠睾丸切除术大鼠的睾丸在未成熟时位于膀胱附近，成熟后降入阴囊内。睾丸呈椭圆形，淡红色。手术前，全身麻醉动物，仰卧固定，术部常规消毒。术者用左手手指轻轻按压腹部，使睾丸进入阴囊内，再用手固定住。然后切开阴囊皮肤将睾丸切除。
2.犬的睾丸切除术犬的阴囊位于腹股沟部与肛门之间的中央部。睾丸比较小，呈卵圆形，长轴自上后方向前下方倾斜。附睾比较大，紧密地附着于睾丸外侧面的背侧方。
（1）术前检查对有外生殖器皮肤病，较大的疝、鞘膜积液、精索静脉曲张等病症者不宜手术。
（2）手术方法全身麻醉动物，仰卧固定。阴囊部剃毛、消毒。术者左手将睾丸挤入阴囊中际线平行的两侧，并用手指固定睾丸，防止回缩到腹沟部。左手持刀，在睾丸最突出的阴囊壁上做与中际线平行的2个切口。切口不宜过大，能挤出睾丸为好。挤出2个睾丸后撕断白筋膜，在精索最细处一次割断2条精索。阴囊切口可不必缝合，涂以碘伏，让其自动愈合。此外，在睾丸脱出后，也可以捻转法切除两侧睾丸，或以结扎法切除两侧睾丸。
3.兔的睾丸切除术兔的阴囊不明显，为贴在腹壁的2个皱褶。鞘膜管较大，与阴囊内的鞘膜腔间无明显界限，因此睾丸可自由地进入鞘膜管和腹腔内。兔的睾丸呈长卵圆形，长度平均为2.5～3cm，宽1.2cm。
手术前，全身麻醉动物，仰卧固定。术前常规消毒。术者以左手中指由前向后逐渐按压兔的腹壁，将2个睾丸挤到阴囊中。右手持刀，切开阴囊皮肤，连同总鞘膜一起挤出睾丸，在精索的地方用丝线结扎，然后在结扎的外方切除睾丸。手术时一定要用丝线结扎总鞘膜，以防肠管通过鞘膜管从阴囊切口内脱出。
4.猫的睾丸切除术猫的阴囊较紧地贴在后臀两股之间，肛门的腹面，正中缝明显。2个睾丸较小，术前可用手指按压小腹，使睾丸进入阴囊。切除方法同犬的睾丸切除法。
（二）卵巢切除术
卵巢切除术是指切除雌性动物的卵巢，方法简单易行，常用于雌性动物的去势。
1.犬的卵巢切除术犬的卵巢完全由卵巢囊覆盖，性成熟之前表面光滑，性成熟后卵巢变得粗糙和不规则。
（1）术前准备术前检查有无处于发情状态。如果发情，最好不要施行手术，以免在切除卵巢时发生大出血。术前禁食半天，以免肠道内容物充满时不易摸取卵巢。全身麻醉动物，仰卧固定。
（2）手术方法在腹壁脐后方至耻骨前部剪毛、清洗、消毒。于腹中线一侧脐部后方向耻骨部切开皮肤，切口长度应根据动物个体大小而定（6～12cm）。分离皮下组织，切开腹白线处腱膜和腹膜，打开腹腔。用食指或卵巢钩伸入一侧腹腔背部搜寻子宫角。左右卵巢和子宫角分别位于左右肾脏后方的腰沟内，屈曲指节将其夹在指与腹壁之间钩出。也可在膀胱背侧找到子宫体，沿着子宫体向前寻找一侧子宫角，此法简单，容易操作。卵巢子宫暴露后用食指和拇指钝性扯断卵巢悬韧带，将卵巢引近创口，注意不要撕破卵巢动静脉。先在卵巢系膜无血管区上开小孔，用三把止血钳顺序钳夹卵巢系膜和血管。然后在靠近卵巢的第一、第二把止血钳间剪断卵巢系膜。绕过第三把止血钳打一单结，除去此钳，将结收紧，再打第二个单结。然后在第二把止血钳下方做一贯穿结扎。用镊子夹住卵巢系膜断端边缘，除去第二把止血钳。如果断端无出血，即可将其还纳正常位置。用同样的方法摘除另一侧卵巢。
2.大、小鼠的卵巢切除术小鼠和大鼠的卵巢都在肾脏下方，呈小球状，表面凹凸不平。
（1）术前准备全身麻醉动物，腹部切口仰卧固定，背部切口俯卧固定。
（2）手术方法小鼠多采用背部切口，大鼠多采用腹部切口。
1）背部切口剃除背部被毛，消毒皮肤。于卵巢部的肌膜做一小切口，用眼科镊子取出卵巢，以丝线结扎。缝合肌肉和皮肤并涂碘酒消毒。
2）腹部切口剃除腹部的毛发，消毒。沿正中线切开腹部皮肤，分离腹肌，寻找卵巢，用眼科镊子取出卵巢，以丝线结扎。缝合伤口并消毒。
（三）卵巢子宫切除术
卵巢子宫切除术是指将雌性动物的卵巢和子宫一起切除，用于雌性大动物的去势。
犬的卵巢子宫切除：犬的子宫角长而直，呈“V”字形。子宫角壁较肠壁厚。子宫阔韧带与肠系膜很相似，但血管较少。
1.术前准备术前检查有无处于发情状态。如果发情，最好不要施行手术，以免在切除卵巢时发生大出血。术前禁食半天，以免肠道内容物充满时不易摸取卵巢。全身麻醉动物，仰卧固定。
2.手术方法卵巢摘取法见卵巢切除法。
两侧卵巢摘除之后，展开两侧子宫阔韧带，沿子宫角旁向后撕裂子宫阔韧带至子宫体部。大犬需要做子宫阔韧带集束结扎，以免出血，小犬只需结扎即可。牵拉两子宫角，将子宫体和子宫颈引出创口外。在子宫颈前方，用三把止血钳并排夹住子宫体，从前、中止血钳间切断子宫体。然后分别打开中、后止血钳钳夹处，贯穿结扎子宫体，并同时结扎子宫体两侧的血管，最后，用镊子夹住子宫体残端，确认无出血后将其送入骨盆腔，用常规方法闭合腹壁切口。术后全身应用抗生素3～5天以防止感染。术后7～10天拆除皮肤缝线。
二、动物的剖腹产手术
（一）小鼠的剖腹产手术
1.术前准备
（1）供隔离器内使用的物品聚氧乙烯薄膜隔离器、小鼠盒、烧杯、纱布、毛巾、脱脂棉、镊子、眼科剪刀、注射器、针头、墨汁。
（2）剖腹手术用器材手术台、照明灯、手术巾、手术刀、剪刀、镊子、止血钳、纱布、5%碘伏、2%过氧乙酸、药液渡槽、传递袋。
（3）消毒隔离器用2%过氧乙酸喷雾，密封2h，通风24h，无菌检查合格备用。隔离器内用物品置于灭菌罐内121℃30min高压蒸气灭菌后传入。外科手术用器材121℃、30min高压蒸气灭菌。手术前将药液渡槽同隔离器连接起来，装上适量的2%过氧乙酸溶液。将传递袋投入药液渡槽中，一头的系带引入隔离器内。
（4）孕鼠的选择在健康群中选出种鼠，将雌雄同居，记录同居日期。当小鼠食欲突然下降、烦躁不安、有做窝行为，胎头与身体大小相同，且外阴潮红并处于开口状态时，该妊娠鼠已临产，应立即进行剖腹产手术。
（5）调温手术前预先将室温、消毒液温度调至35℃。
2.手术过程颈椎脱臼法处死孕鼠，将其全身浸入5%碘伏液中，待浸湿毛后立即取出。背部固定于手术台上，切开腹部暴露子宫，用止血钳夹住子宫颈及两侧输卵管，在止血钳外侧切断，连同止血钳取下子宫，放开止血钳，用纱布裹住子宫，放在传递袋中。通过隔离器拉动传递袋的系带，将子宫拖入隔离器内。迅速用大量无菌水清洗子宫，切开子宫，取出胎仔。擦掉口、鼻上的羊膜、羊水、拧断脐带，擦干身体，促其呼吸，体色由紫色转为鲜红色后放入鼠盒中保温。清除隔离器中的废弃物，用注射器将墨汁注入小鼠皮肤进行编号。
（二）大鼠的剖腹产
1.术前准备
（1）器材与消毒参照小鼠剖腹产术。
（2）孕鼠的选择选择健康动物，检查阴道栓的产生，确定配种日期。发现有预产征兆应立即进行手术。手术在产前2h进行较易获得成功，过早影响人工哺乳成活率，过迟则丧失机会或造成感染。
2.手术过程CO2麻醉动物，麻醉时，取干冰适量放入烧杯中，加少量水，使之产生二氧化碳，将烧杯罩在大鼠头上，使其仰位固定在手术台上。用5%碘伏将胸腹部浸湿消毒，盖上手术巾，沿腹中线切开皮肤。用止血钳把切开的皮肤与手术巾钳合，分离皮肤与肌肉，用碘伏消毒胸骨柄至后腹部，沿胸剑骨处至后腹部切开腹肌暴露子宫，切勿划破肠管，用止血钳夹住子宫颈与两侧输卵管，并切断。将子宫放入传递袋中，经灭菌渡槽移入隔离器内。用大量无菌水冲洗子宫，用2把镊子将子宫撕破取出胎仔，另一人擦去口、鼻部羊水，促其呼吸，擦干胎仔身体。当胎仔体色由紫转红润后放入鼠盒保温，清除隔离器中的废弃物，将胎仔编号。
（三）犬的剖腹产
1.术前准备
（1）手术隔离器的准备犬的体形较大，隔离器各种用品及消毒灭菌同前，与隔离器相连接的药液渡槽及传递仓口径相应要增大，以便仔犬顺利通过。
（2）孕犬的选择在健康犬群中选取经产雌犬，于发情开始后2～4日配种，记载配种日期。确定怀孕后，于配种后60天左右准备手术。分娩前母犬外阴和乳房肿胀，食欲下降或不食，是手术的时机。
2.手术方法
（1）麻醉按20mg/kg剂量注射氯胺酮，10min左右，进入麻醉期。
（2）固定与消毒将犬仰卧固定，于腹部手术区域剪毛，用3%碘伏消毒，以75%乙醇脱碘。将灭菌巾固定在皮肤上。
（3）剖腹取胎沿腹白线，从脐后至耻骨前3cm切开皮肤，打开腹腔，移出两子宫角。在子宫角中部做一切口，以灭菌塑料袋口对准切口，将胎盘包裹的仔犬引入袋中，用止血钳夹住袋口，每袋一犬，将袋浸入药液渡槽传入隔离器内，迅速打开塑料袋，切开胎盘，取出仔犬，留2cm脐带切断，擦净口、鼻、体表黏液，放入保温盒中。采用子宫切除术在无菌方面更保险，但要损失种犬。
（4）术后护理母犬按常规缝合切口，做外科处理，精心护理，康复后可继续繁殖。
第三节 生殖细胞的培养
细胞培养技术（cell culture）是从动物体内取出细胞，模拟体内的生理环境，在无菌、适温、丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。细胞培养技术是离体方法中主要的一种。
一、睾丸间质细胞、支持细胞和生精细胞的分离与培养
（一）材料准备
1.仪器设备超净工作台、CO2培养箱、离心机、低温冰箱、恒温水浴、普通及倒置显微镜及一般实验室设备如网筛、滤器等。
2.器械与器皿手术剪、手术刀、培养皿、注射器。
（二）操作步骤
1.睾丸间质细胞的分离和培养选取16～18日龄的雄性SD大鼠，无菌条件下取出睾丸，用培养液洗3次，剥去白膜，剪碎（至1mm3），用0.5%胶原酶和0.1%透明质酸酶，36℃振荡消化15min，静置4min；吸取上清液，过400目不锈钢筛网，滤液1000r/min离心5min。去上清液，用培养液洗涤3次，以除去残留的酶。离去洗涤液后，加入一定量的培养液，制成间质细胞悬液。计数，按每孔（1～2）×105个细胞接种于24孔培养板中。置于37℃，5%CO2培养箱中培养。24h贴壁后，更换培养液，除去悬浮的细胞碎片，继续培养（注意设空白对照和溶剂对照）。以细胞的存活率、细胞的形态变化和细胞在hCG刺激下，内源性地合成、分泌的睾酮到培养液的含量为指标，观察和分析测试药物对间质细胞的直接作用。
2.支持细胞的分离和培养在（1）去除间质细胞后的曲细精管小段，经0.3ml、0.5%胶原酶，35℃消化20min。待小管稍下沉后，弃去上清液。再经0.08%胶原酶在35℃水浴，振荡，消化4min，通过200目不锈钢筛，滤液静置4min，去除悬浮在上清液的血细胞、间质细胞和精原细胞。此后操作同（1）。细胞培养24h后，支持细胞均已贴壁展开，显微镜下观察几乎无其他细胞混杂，更换培养液，除去悬浮的细胞碎片。并加入受试药物继续培养。以细胞存活率、细胞形态变化及细胞在FSH刺激下将雄烯二酮转化为雌激素的能力为指标，观察测试化合物对支持细胞的直接作用。
3.生精细胞的分离和培养选用90日龄的SD雄性大鼠，无菌条件下，摘取一对睾丸，剔除包膜，切成碎块（1mm3），和胶原酶（1mg/ml）、DNA酶（20μg/ml）一起孵育45min，34℃，以去除间质细胞和类肌样细胞。余留的曲细精管碎块用胶原酶（0.1mg/ml）进一步消化10min，然后通过滤膜，滤去细胞残片，制得生精上皮单细胞悬液。用DMEM洗2次，重新混悬在含有0.5%BSA、1mmol/L EDTA、0.5%mmol/L葡聚糖钠和5mmol/L 乳酸钠的Han’s F12/DMEM中，收集经过淘析器得到较纯的生精上皮细胞，并用F12/DMEM 洗2次，然后重新混悬在含有10——7mmol/L的睾酮、10mmol/L乳酸钠、0.7%mmol/L 丙酮酸钠和2mmol/L L-肤胺的F12/DMEM中。在光镜下计数细胞，观察纯度，并稀释至1×106细胞/ml。培养在含20～30ml的生精细胞培养液的100nm培养皿中；每天更换一次培养液，培养24h后，生精上皮细胞已贴壁展开，镜下观察几无其他杂细胞。加入含待测化合物的新鲜培养液，处理72h后，终止实验。以细胞存活率或细胞形态改变为指标，观察待测化合物的直接作用。
二、黄体细胞的分离和培养
1.材料准备同上。
2.操作步骤取22～25日龄的幼年雌性SD大鼠，皮下注射孕马血清促性腺素（PMSG）30IU/只，65h后皮下注射人绒毛膜促性腺素（hCG）50IU/只。HCG处理后第5天，在无菌条件下取出双侧卵巢（此时的卵巢几乎全部由黄体组织构成）。用培养液洗涤3次后，剥去外层白膜，用4号针头刺破黄体，再将之剪碎。用0.1%BAS-HEPES培养液稀释胶原酶，使其最终浓度为200IU/ml，以组织量的3倍加入消化液，在36℃恒温水浴振荡消化（每隔5min用吸管吹打1次），20min后吸出上清液过150目不锈钢滤网。加入一定量含5%新生小牛血清的McCoy’s 5A培养液成细胞悬液，计数细胞，按（1～2）×105个细胞/孔的浓度种于涂有鼠尾胶的24孔培养板中，培养板置于37℃，5%CO2培养箱，24h后，更换不含血清的McCoy’s 5A培养液，加入受试物，继续培养。
三、卵泡细胞的培养
1.材料准备同上。
2.操作步骤取22日龄的雌性大鼠，于晨8时皮下注射DES油溶液，每次0.5mg，每天1次，连续3天，第4天晨9时处死大鼠；在无菌条件下，迅速取下卵巢，去除周围组织及卵巢表面包膜，用冰冷McCoy’s 5A培养液洗涤3次。解剖镜下，用4号不锈钢针刺破卵巢表面的成熟卵泡（每只卵巢可有10～15个发育成熟的卵泡），使颗粒细胞释放于培养液中。弃去卵泡膜后，将颗粒细胞转移至10ml无菌的刻度离心管中，4℃、1000r/min 离心7min，弃上清液；向沉淀在管底的疏松细胞团块加入新鲜的MCsy’s 5A培养液，吹打均匀，并稀释到2×105/ml颗粒细胞悬液混匀，分装于Falcon多孔培养皿，每一培养皿含1ml颗粒细胞悬浮液。然后，置于37℃，5%CO2培养24h。更换培养液，加入含受试物McCoy’s 5A培养液，继续培养。
第四节 大鼠离体子宫实验方法
子宫的活动及对药物的敏感性随着动情周期而变化，对动情周期较短的动物，如小白鼠或大白鼠，可根据阴道细胞学检查，挑选动情期的动物进行实验。也可以在实验前1～2天，每天给动物皮下注射己烯雌酚0.1mg/kg体重，人工造成动情期，以提高子宫的敏感性。
一、实验器材
平滑肌离体灌流恒温装置、常用手术器械、自动控温仪、记纹鼓或记录仪、通用杠杆或张力换能器、温度计、显微镜、铁支架、载玻片、盖玻片、氧、棉线、缝针、培养皿、肾上腺素（1：10000）、催产素（0.1单位/ml）、低Ca2+洛氏液、己烯雌酚。
二、操作步骤
1.取体重280～350g左右，成年未孕雌性大白鼠，经阴道涂片镜检确定其处于动情期后，用颈椎脱臼法处死，背位固定于腊盆上，剖开腹腔，用镊子轻轻拨开附在肠系膜上的脂肪，可见一对粉红色的卵巢和与它相连的子宫角，末端是阴道。迅速从卵巢与子宫角间剪断，下端在阴道处剪断，取出两侧子宫。立即把子宫放入盛有低Ca2+洛氏液并通O2的培养皿中，轻轻剥离子宫壁上的结缔组织和脂肪组织。从阴道处纵向剪开，将一侧子宫角的下端（连阴道端）穿入一“S”形不锈钢小钩，然后把小钩固定在营养管底的弯钩上。子宫角的另一端（连卵巢端）用缝针穿线结扎，把结扎线与描记部分相连。营养液的温度保持在30～32℃，并不断通入O2.
2.为保证子宫比较稳定地活动，必须对子宫加一定负荷，一般以1g为宜。加负荷的方法是在杠杆未与子宫连接前，先确定放大倍数（短臂与长臂的比例，即为放大倍数，如短臂为1，长臂为5，即放大5倍）。然后在短臂末端加适当负荷，使长短臂两侧重量处于平衡状态，这时在长臂侧与子宫连接点离支点等距离处加上的重量（如1g）即为子宫的负荷。
3.固定标本以后，应在营养液中稳定20min才进行实验。先描记子宫平滑肌的正常活动曲线，然后向营养液中加入0.02ml催产素，可见子宫活动加强，待效应明显之后，描记2～5min，便更换新鲜营养液冲洗2～3次。等标本恢复活动后，间隔20min再进行下一次实验。如加入肾上腺素（1：10000）0.04ml，同样观察和记录子宫活动的变化。
4.子宫平滑肌正常活动和加入各种药物后，观察的指标为强度（幅度）与频率。幅度即以每次收缩所达到的最高点表示。频率以每10min收缩的次数表示。子宫活动力，以强度和频率的乘积表示。
三、注意事项
1.操作过程中应避免过度用力牵拉子宫组织，而且操作时间尽量短些，并注意供给O2.
2.低Ca2+洛氏液能消除子宫平滑肌的自发运动。可把洛氏液配方中的CaCl2由0.24g/L 改为0.06g/L。
3.每次加入药物后的观察时间，更换新鲜营养液的次数及2次加入药物的间隔时间均应尽可能保持一致。
4.由于子宫平滑肌的活动十分缓慢，其收缩频率约0.75次/min，若通过张力换能器和记录仪记录时，由于记录仪的走纸速度快，往往描记不到理想的曲线。若用电动连续记纹鼓记录，利用其走纸速度慢（0.08～0.15mm/s）的优点，可以长时间描记实验结果，比较方便。
