第一节 免疫学研究中的动物实验方法
一、动物免疫血清的制备
免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术，高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂，也可供特异性免疫治疗用。
（一）动物的选择
选择合适的动物进行免疫极为重要。用于免疫的动物应适龄、健康、无感染性疾患，常用的有兔、山羊和豚鼠等。选择免疫动物时应考虑：①抗原与免疫动物的种属差异越远越好，若亲缘关系太近则不易产生抗体应答；②抗血清量的需要；③抗血清的要求；④抗原的选择。此外，还需重视动物的饲养，以消除动物个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
（二）佐剂
由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂能延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用，还能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
（三）免疫剂量、时间和途径
制定不同抗原的免疫血清的程序各不相同，应选择合适的免疫原剂量、免疫途径和免疫间隔时间。
1.免疫原剂量免疫原剂量的选定应考虑抗原性强弱、相对分子质量大小和免疫时间。抗原需要量多，时间间隔长，剂量可适当加大。
2.免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉、腹腔、肌内、皮内、皮下、淋巴结注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
3.免疫间隔时间免疫间隔时间也是重要因素，特别是首次与第2之间更应注意。一般以间隔10～20天为好。2次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体，有时总时间为1年以上。
（四）动物采血法
动物免疫3～5天后，如抗血清鉴定合格，应在末次免疫后5～7天及时采血，否则抗体水平将会下降。因故未及时取血，则应补充免疫一次（肌内、腹腔或静脉注射，不加佐剂），过5～7天取血。动物常用采血方法如下。
1.颈动脉放血法这是最常用的方法，对兔、山羊等动物皆可采用。具体操作如下：在动物颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的颈动脉。将此动脉轻轻游离（连同与之同行的迷走神经），用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端放入瓶口，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快，动物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时，暂时将动脉夹住片刻，再继续放血，得血量可以多些。
另外一种慢放血法是在动脉内插入一采血器，用闭式放血。在颈动脉内插入一较粗的玻璃管，将血管与玻璃管用线扎牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也极为方便。
2.心脏采血法此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘的正中，选心跳最显的部位做穿刺。针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血，采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。
3.静脉多次采血法兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法，1只兔可采百余毫升血液（用颈动脉放血最多可获70～80ml，一般只有50ml左右）。用颈静脉采集绵羊血，一次可放300ml，放血后立即回输10%葡萄糖盐水，3天后仍可采血200～300ml。动物休息1周，再加强免疫1次，又可采血2次。如此，1只羊可获1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超过2ml。
抗血清的分离多采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝块收缩。
（五）免疫失败的可能原因及应采取的措施
有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。
1.动物种属免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。
2.抗原质量抗原质量是否良好，可改用其他厂家的产品或改用同一厂家的其他批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。
3.免疫原制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂、载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。
4.佐剂所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其他佐剂，或加强乳化。
5.实验方法免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。
6.动物饲养动物饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。
二、单克隆抗体的制备
单克隆抗体是由单个克隆B细胞产生的，在分子上是同质的抗体。1975年Kohler和Milstein创立了单克隆抗体杂交瘤技术。克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫
1.动物的选择多选用纯种BALA/C小鼠。
2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前2个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。免疫途径如下：初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点）；3周后，第2次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或腹腔内注射（剂量不宜超过0.5ml）；3周后，第3次免疫剂量同一，不加佐剂，皮下（5～7天后采血测其效价；2～3周，加强免疫，剂量50～500μg为宜，皮下或静脉内注射；3天后，取脾融合。
（2）颗粒抗原颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为（1～2）×107个细胞。初次免疫1×107/0.5ml 皮下注射，2～3周后，第2次免疫1×107/0.5ml 皮下注射。3周后，加强免疫（融合前3天）1×107/0.5ml 皮下注射或静脉注射，取脾融合。
（二）细胞融合
1.细胞融合前准备
（1）骨髓瘤细胞系的选择骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640、DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以（104～105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代1次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
（2）饲养细胞在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
2.细胞融合的步骤
（1）制备饲养细胞层一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周。拉颈处死，浸泡在75%乙醇内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管），反复冲洗，吸出冲洗液。冲洗液放入10ml离心管，1200r/min，离心5～6min。用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml。加入96孔板，100μl/孔，放入37℃CO2孵箱培养。
（2）制备免疫脾细胞最后一次加强免疫3天后，小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，用培养液洗1次，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取1×108脾淋巴细胞悬液备用。
（3）制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得1×107细胞备用。
（4）融合
1）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1200r/min，离心8min；弃上清液，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
2）90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（相对分子质量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
3）加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
4）离心，800r/min，6min。
5）充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
6）将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl，一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
7）将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
1.HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述2种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
2.抗体的检测检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测；酶联免疫吸附实验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测；免疫荧光实验适合于细胞表面抗原的McAb的检测；其他如间接血凝实验、细胞毒性实验、旋转黏附双层吸附实验等。
（四）杂交瘤细胞的冻存与复苏
1.杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。
细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
2.细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤2次，然后移入前一天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
（五）单克隆抗体的大量生产
1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml，如果大量生产，费用较高。
2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清
（1）实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按（1～3）×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml，共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/ml，但采血量有限。
（2）腹水的制备常规是先腹腔注射0.5ml Pristane或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
三、移植性肿瘤整体动物模型的制备
把人的肿瘤细胞通过合适的方法移植到适合的宿主体内，建立一个移植宿主的体内模型，通过该模型对受试物进行观察。
（一）移植宿主的选择
在肿瘤移植模型的建立中，移植宿主的选择非常重要，如果没有适宜的移植宿主动物，肿瘤移植模型就难以建立，此外，还应该考虑移植宿主对肿瘤传代保种的影响。
目前常用的宿主动物主要裸小鼠和C57BL/6小鼠。这2种动物为国际所承认，裸小鼠是一种较为理想的动物，该鼠先天性无毛，无胸腺，T淋巴细胞功能缺乏，对异种移植不产生排斥反应，用来移植人体肿瘤组织块的癌细胞成功率高。但价格昂贵，饲养时对实验室的条件要求高，小鼠不易大量繁殖。C57BL/6小鼠是一种黑毛，体形小的小鼠，它性情较温驯，易于饲养管理，费用适中，饲养条件不高，容易大量繁殖，因此常用于受试物的筛选研究。
（二）肿瘤细胞的来源与保存
通常人体肿瘤细胞的来源大致可分为2类，一类是人的癌细胞株；另一类是源于人体肿瘤组织块的癌细胞。为了使肿瘤细胞能得到长期使用和保持不同代的肿瘤组织的本来特性，防止退化或变异，对肿瘤细胞的冷冻保存是很必要的。一般情况下，液氮冻存1～2年后，细胞存活率可达80%～90%，有的可存活时间更长。
1.冻存方法在冻存前，应选好肿瘤组织或细胞系。将对数增值期的细胞或腹水瘤细胞经消化脱壁后，用培养液洗涤1次。配合含有保护剂（10%～15%的DMSO，甘油等）的培养液作为细胞冻存液。以肿瘤细胞在细胞冻存液中的密度为1×107个细胞/ml左右悬浮细胞。准备冻存的细胞悬液加入到2ml塑料冻存管内。将冻存管放入4℃或-30℃低温冰箱内2h后，移入液氮罐内长期保存。
2.冻存细胞的复苏
（1）将冻存的肿瘤细胞冻存管从液氮罐内取出，立即置于37～40℃温水中，使冻存细胞在1min内全部融化。
（2）用1000r/min，离心10min，弃去上清液，用新鲜培养液稀释到所需细胞数，再进行培养。
（三）实体瘤动物模型的建立
1.器械与试剂
（1）无菌室和超净工作台。
（2）外科手术器械。
（3）消毒用碘酒、乙醇。
2.实验方法
（1）小块瘤体接种法从动物体内剥离取出肿瘤后，剔除非肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、呈淡红色（黑色素瘤则呈黑色或黑紫色）鱼肉状的瘤组织，切成5mm×5mm×5mm的小块，在所选宿主动物的腋下剪开一个小口，用无钩眼科镊子夹取小块，送入切口内皮。腋下部皮肤松弛，能使肿瘤生长得很大，宿主动物的寿命也可延长。
（2）肿瘤细胞悬液接种法将选取的肿瘤组织放入玻璃匀浆器中，用无菌生理盐水研磨后，经滤网过滤成单个的细胞悬液，用台盼蓝染色法计数活细胞数，每个接种点以0.2ml，1×106～1×107个细胞数用1ml的皮下注射器注射到接种部位，每只动物可选用多个接种点，通常接种于腋下部皮下。癌细胞数过多，接种后瘤体生长过快，不便于受试物作用的观察，癌细胞数过少，会导致接种失败，接种部位不能形成肿瘤，此时在原动物体内再重新接种也难成功，必须重新更换动物。制备肿瘤悬液，在研磨时必须使研磨杆向同一方向转动，不可反向交替研磨，防止磨破肿瘤细胞；如果采用电动研磨，一定要控制好转速，以免破坏完整的肿瘤细胞。
（3）培养细胞动物体内移植法将培养至快要融合的单层细胞（对数生长期）用0.25%胰蛋白酶消化脱壁后，经用PBS或生理盐水以1000r/min经10min离心洗涤2次后，洗掉细胞中胰蛋白酶和培养液中血清等成分，用台盼蓝染色法计数活细胞数，用生理盐水将肿瘤细胞稀释成1×106～1×107浓度，细胞悬液置于冰上，每个接种点以0.2ml，1×106～1×107个细胞数，用1ml的皮下注射器尽快注射到动物体内接种部位。
（4）活细胞计数方法用新鲜配制成0.05%伊红或0.1%台盼蓝生理盐水溶液，将肿瘤细胞悬液稀释，混匀后在血球计数板上计数，染色者为死细胞，不染色为活细胞。
3.实验结果
（1）实体瘤测量方法对于实体瘤的测量，有许多种方法。主要有测定肿瘤的质量、体积或直径等方法。通常于停药之后次日处死动物，立即剥离取出瘤块，剔除其他组织后称重。若对照组小鼠肿瘤平均＜1g或20%小鼠的瘤重＜400mg，表示肿瘤生长不良。在治疗期间给药组小鼠死亡率＞20%或平均体重下降（自身对照）超过15%者，表示受试物毒性反应，应适当减量重复试验，比较试验组与对照组瘤重的差异，按下列公式计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率=对照组瘤重-给药组瘤重对照组瘤重×100%
（2）瘤体的测量测量瘤体，不需处死动物，用游标千分卡尺测量肿瘤的3个互相垂直的直径（包括皮肤的厚度在内），取它们的平均值即为平均直径。
（四）非实体瘤动物模型的建立
以腹水瘤为例，腹水瘤移植接种方法如下。
1.器械与试剂同上。
2.动物小鼠6～7周龄，体重18～22g的健康小鼠。每批动物只用一种性别，腹水型肿瘤一般用雌性动物接种。
3.实验方法取出小鼠接种后第5～7天的腹水，用生理盐水稀释到1×106～1×107个细胞数，用1ml的皮下注射器注入动物腹腔，一般接种量为0.1～0.2ml。腹水瘤的传代方法与移植接种方法一样。肿瘤移植应严格无菌操作，接种时间应尽可能短，不应超过半小时。
4.腹水瘤测量方法腹水瘤的测量方法是对小鼠进行每天1次的称量体重，然后进行自身对照或用空白对照进行比较，观察体重的变化。
5.腹水型肿瘤疗效评价一般在疗程结束后次日称体重，逐日记录。通常对照组在2～3周内死亡，若治疗期间对照组动物死亡大于等于20%或其20%存活时间长于4周以上，实验均为作废。治疗组观察时间一般为50天左右，按下列公式计算生命延长率。
生命延长率=治疗组评价存活天数-对照组平均存活天数对照组平均存活天数×100%
非腹腔给药时生命延长率＞50%，腹腔给药时，生命延长率＞75%，则认为有疗效，连续3次，疗效稳定，则评价此受试物有一定疗效。
四、免疫荧光细胞化学染色法
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。免疫荧光细胞化学分为直接法、间接法和补体法。
（一）标本制作
经过涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片等步骤，经适当固定或不固定，做免疫荧光染色用。
（二）直接法
直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
1.染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ——球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
2.洗片倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH值7.4或pH值7.2PBS中洗2次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
3.固定用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH值9.0～9.5）甘油封固、镜检。
4.对照染色①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验（略）。
（三）间接法
间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于试验。又分为双层法和夹心法。
1.双层法
（1）染色切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH值7.2PBS洗2次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
（2）洗片再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min、37℃，缓冲盐水洗2次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
（3）对照染色①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。
2.夹心法即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内；②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃、30min；③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干；④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃、30min；⑤如③水洗；⑥缓冲甘油封固，镜检。
（四）补体法
本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。
1.材料
（1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers 盐水做2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应做1：8稀释。
（2）补体用新鲜豚鼠血清，一般做1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH值7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
2.方法步骤
（1）涂片或切片固定。
（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。
（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。
（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min、37℃，水洗同（3）。
（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。
3.对照染色
（1）抗原对照。
（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。
（3）灭活补体对照：将补体经56℃、30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。
（五）染色法
1.膜抗原荧光抗体染色法本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。
2.双重染色法在同一标本上有2个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法。
（1）一步法双染色先将2种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。
（2）二步法双染色先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。
3.荧光抗体再染色法若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再做免疫荧光或其他免疫细胞化学的染色。
4.荧光抗原染色法某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少，一般很少采用此法。
五、活细胞免疫荧光技术——流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪（flow cytometry，FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。FCM以它的快速、灵活及定量的特点被广泛地应用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面，尤其是结合单克隆抗体技术，在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重要作用，成为现代免疫技术的重要组成部分。
（一）原理
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）试剂和器材
1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10%FCS RPMI1640，DPBS、洗涤液、固定液。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）操作步骤
（四）注意事项
1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
第二节 微生物学研究中的动物实验方法
一、动物感染病毒的接种方法
病毒缺少自我繁殖能力，必须依赖宿主细胞进行繁殖，各种活体动物及禽类的胚胎都可供病毒大量繁殖，是用来繁殖病毒的主要手段。常用的动物有大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔等。
（一）接种途径、方法及接种量
动物感染病毒的接种途径包括皮内接种、皮下接种、肌内接种、腹腔接种、静脉接种、脑内接种、经口接种等。各种动物不同接种途径的注射方法简要叙述如下。
1.皮内接种指将接种物注入皮层内。选用带4号针头的卡介苗注射器，一般每点注入0.1～0.2ml。注射后接种部位鼓起小包，表面苍白，表明注射正确。
2.皮下接种指将接种物注射在皮下结缔组织层内。小鼠、兔多选择颈背部皮肤较薄处接种，背部皮肤较厚的动物如豚鼠、大鼠、犬、猫，接种不易操作的，通常豚鼠在大腿内侧，大鼠在下腹部，犬和猫在大腿外侧。
3.肌内接种指将接种物注入肌肉之中。肌内注射吸收快，肌肉感觉神经比皮下少，较皮下注射疼痛轻。通常大鼠、小鼠选择腹部，犬、兔、猫、猴选择臀部或股部，禽类选用胸肌，注意不要将针头扎入胸腔内。
4.腹腔接种指将接种物注射到腹腔内。操作时使动物头部低于尾部，腹部朝上，这样动物腹腔器官就会前移，避免扎伤腹部脏器，通常在脐后近腹白线处进针，由皮下斜刺入。注射量：小鼠0.2～0.4ml，大鼠2～4ml，兔3～5ml。
5.静脉接种不同动物的静脉注射部位不同。大、小鼠多选择尾静脉，兔耳外缘静脉，豚鼠耳静脉或后肢小隐静脉，犬后肢小隐静脉或前肢内侧皮下静脉。
6.脑内接种指将接种物注射到脑内。大、小鼠的脑内接种选择两眼窝后缘连线稍偏中线的部位，针头刺破皮肤，垂直于额部刺入2～3mm，感到阻力减轻时，缓慢注入0.02～0.03ml。兔、犬、豚鼠等脑内接种时，将额部皮肤向一侧拉紧，用手术刀划一小口，用穿颅钢针通过切口在头盖上开一小孔，通过小孔将注射器插入颅内缓慢注射，每次注射量0.1～0.2ml。
7.经口接种指将接种物注射到口内。通常将动物头部抬高，后躯降低，固定好动物，经动物口角，将注射器插入口中，往动物舌后部送，推动注射器，让动物自动吞咽。注射完毕后，用手触摸动物咽部，促其吞咽。
（二）收获方法
动物接种后，经过一定时间后，会产生病症或死亡，对这些死亡或杀死的动物进行剖检，采集病变明显的病料或肝、脾、肾、心脏、肺、脑组织、淋巴结、血液、腹水、脑积液等，置于密闭容器内，除立即使用外，放入低温冰箱保存。
1.动物的尸体剖检将手术器械高压消毒，试管、培养皿及其他器皿高压灭菌。大小鼠的尸体用大头针固定于固定板上，兔、豚鼠等用绳子将其四肢绑在解剖板的钉子或环上。尸体放入较大的盘子中，用消毒药水浸湿动物皮毛，用手术刀在胸部皮肤做一切口，用剪刀向前剪至颈部，向后剪至耻骨部，沿此线向四肢方向剪开，剥离皮肤。采集脑组织时将动物背部朝上固定，最后，依次剖开腹腔、胸腔及脑室。
2.病料的采集用无菌剪刀、手术刀、镊子等，分离肝、脾、肾、心、肺、脑组织、淋巴结等器官。用无菌的吸管吸取腹水、胸水、心包液、脑积液、血液、尿液等体液，分离胃、小肠、大肠，将肠内容物挤出，采集肠及肠内容物，分别保存。
（三）尸体及废弃物的处理
动物尸体及废弃物用包装袋密封好送焚尸炉烧毁。所用器械经高压蒸气灭菌，解剖板、盘子等用消毒药水浸泡，操作人员手用消毒药水浸泡后再用清洁剂洗净，工作服经消毒药水浸泡或高压灭菌后清洗。
二、动物感染细菌和真菌的实验方法
（一）动物感染细菌的实验方法
细菌是引起人类传染性疾病或人畜共患病的重要病原体之一。通过动物接种细菌，人类可以更好地研究和了解病原菌的致病机制、疾病的发生、发展过程，从而开展有效的预防和治疗。
1.动物感染细菌的方法
（1）皮内接种通常以背部皮肤进行接种较为合适。接种量一般为0.1ml。此种方法主要用于皮肤感染的研究。
（2）皮下接种接种部位宜选择皮肤比较疏松的部位，如腹部、腹股沟，但由于操作不便，实际操作中仍以背部接种为多，接种量0.1～1.0ml。此种方法适合于皮下感染的研究。
（3）肌内接种一般以动物的后腿根部较适宜，但家禽多选用胸部。接种量0.2～1.0ml。此种方法常用于某些毒素的毒性和生物学作用的检验，或检测抗毒素的中和作用。
（4）静脉接种常选用兔、小鼠、大鼠和豚鼠，兔一般选用耳缘静脉，大、小鼠选用尾静脉，豚鼠选择后腿静脉。此种方法主要用于血源性感染或败血症的研究。
（5）腹腔接种多选用小鼠，接种量0.2～2ml，此种方法常用于腹腔感染动物模型的复制或细菌检验时需要恢复细菌的特殊结构、形态或细菌毒力的鉴定和恢复。
（6）颅内接种对小动物（如小鼠）可在动物颞部穿刺，刺入为0.3cm左右，注射量0.01～0.03ml，对较大动物（如兔）需用骨钳将局部打开后接种，刺入深度为0.6cm左右，注射量为0.05ml。主要用于颅内感染的研究。
（7）足垫接种将吸有接种物的注射器针头刺入足垫皮下，接种量一般0.1ml。此种方法主要用于麻风杆菌的接种感染。
（8）呼吸道接种主要有鼻前庭吸入接种和气管穿刺接种2种：①鼻前庭吸入接种，将动物用乙醚浅麻醉，用卡介苗注射器吸取接种物，接上4.5号头皮针，去除针头，排除空气，将头皮软管插入动物的鼻前庭，在动物吸气时注入0.1～0.5ml左右的接种物，可反复多次接种；②气管穿刺接种，将动物用0.3%的戊巴比妥钠麻醉、固定后，剪开颈前皮肤，肌肉层做钝性分离，暴露器官，用吸有接种物的卡介苗注射器（4号针头）向气管注入0.1～0.5ml接种物。此方法一般不能反复接种，主要用于急性感染性肺炎的研究。
（9）泌尿系统接种因动物泌尿道细小，接种困难，此种方法少用。较大的动物，如兔等可进行膀胱穿刺接种，接种量1ml左右。
（10）阴道接种动物以往主要采用猴和兔，近年来主要采用大鼠。需特制的导管，导管有适宜的刚性和弹性，顶端圆润，尾部可与注射器乳头结合。吸取接种物，排出气体，将导管轻柔地沿动物脊柱方向插入大鼠的阴道内，插入深度一般为5～8cm，回抽注射器如有黄色液体，表明插入膀胱，如仅有少量分泌物或无分泌物抽出，表明插入阴道，注入接种物，一般0.5ml左右。
（11）消化道接种常采用灌胃法，一般小鼠插入深度3cm，大鼠、豚鼠或幼猫5cm，兔15cm，犬20cm。灌胃量视细菌种类和接种的目的而定。主要用于某些细菌制剂的研究。
2.动物感染成功的标志主要包括两方面：①动物的非特异症状，如动物感染后出现的食欲减退、精神萎靡、体重减轻，皮毛失去光泽、血常规改变、体温上升，局部出现红肿，脓性分泌物等炎症现象，局部分泌物的颜色、pH值改变等；②特异性标志，在局部炎症分泌物或发热期（菌血症）血液中分离到接种菌。
3.接种动物的解剖和病理学检查动物死亡后应及时解剖并做微生物检验。如不能及时解剖，应将动物包好，置于低温冰箱保存。否则，动物易腐烂，肠道中的细菌易穿过肠壁进入血液和其他脏器，给微生物检验造成困难。
解剖前应先注意观察动物外表的情况改变，如接种部位的脓性分泌物的情况、体重的变化、体形的改变等。解剖时必须采用专用的解剖台、敷料和手术器械，在解剖某些传染力较强或抵抗力很强的病原体感染而死亡的动物时，必须在专用的实验室进行，以便手术后的消毒处理。
操作者穿隔离衣，戴手套、口罩和手术帽，然后取一搪瓷盘，底部铺一层用消毒液浸泡过的纱布，将动物固定在一覆盖有油纸或塑料薄膜的解剖台上进行解剖。剖检过程简要如下：局部准备解剖皮肤层打开腹腔打开胸腔打开颅腔。
4.解剖后的处理对所用器械、操作环境和工作服进行消毒灭菌处理，死亡的动物、笼盒、垫料做高压灭菌处理，动物饲养环境也应进行消毒灭菌。消毒必须完全，以防止实验室工作人员的感染和细菌造成疾病的发生、流行。
（二）动物感染真菌的实验方法
动物感染真菌的实验主要用于双相型真菌的鉴定、恢复并加强保存菌种的活力和毒力、抗真菌药物的前期研究等。
1.动物的选择多数深部真菌和少数皮肤癣菌可用于接种动物，进行感染研究。由于不同动物对不同的病原菌易感性不同，根据菌种的特点选择适当的动物非常重要。
2.动物的处理对正常动物进行真菌感染之前，通常需要对动物进行预处理，常见的方法有：注射免疫抑制剂、切除器官（唾液腺、卵巢）、膀胱输尿管回流（稀醋酸液经尿道）、喂低蛋白食粮及麻醉等。免疫抑制剂常用环磷酰胺、醋酸可的松、糖皮质类固醇、环孢菌素A等。还可采用放射线照射处理。
3.标本的接种接种的标本有临时标本，如磨碎的病理组织、脓液、尿液等，但常用的是已培养分离的纯菌种。菌种应用生理盐水制成混悬液，加入等量的5%猪胃黏素增强菌种的感染力。
（1）酵母和酵母样菌的接种酵母和酵母样菌主要指新生隐球菌和白色念珠菌。先制成生理盐水混悬液，浓度一般为106/ml。接种5～10只小鼠。每只接种量：静脉注射0.2ml，腹腔接种0.5～1.0ml。以后每隔2～3天处死1只小鼠。取肾、肝、脾、脑或肺做组织病理切片、真菌直接检查和培养，以检查和分离病原菌，观察病理反应。
（2）双相型真菌的接种
1）球孢子菌接种于豚鼠睾丸，接种5只。接种量为0.2～0.3ml，或以0.5～1.0ml做小鼠腹腔注射。以后每周处死1只动物。检查内脏和肺，观察有无球囊和内孢子。
2）芽生菌一般不用动物接种检查法，因动物对皮炎芽生菌多不敏感。若使用动物，可采用0.5～1.0ml注射于小鼠腹腔内，每周处死1只。检查腹腔、肝、脾或横膈上有无脓肿，进行涂片检查和培养。
3）孢子丝菌接种于豚鼠睾丸和腹腔内，小鼠和地鼠则腹腔接种，也可接种于鼠足垫内。睾丸接种后5～10天接种处有红肿，足垫则在～8天内出现红肿，腹腔接种后3～4天内有腹膜炎出现。
（3）放线菌的接种
1）以色列放线菌接种于硫乙醇钠肉汤中厌菌培养7天。2000r/min下离心15min。取沉淀物与新鲜肉汤按2%浓度配制，于振荡器上混合均匀。取小鼠5只，每只右侧腹腔注射0.8ml 5%胃黏素，左面腹腔内注射0.2ml接种液。以后3，5，10，14和21天各处死1只小鼠。检查横膈、肝、肠系膜上有无脓肿，并做涂片和37℃厌氧培养。
2）星形奴卡菌和巴西奴卡菌移取整个菌落，置于无菌研钵中，加等量5%猪胃黏素，研磨成匀浆。取5只小鼠，腹腔内注射各1ml接种液。其余同以色列放线菌。
（4）临床标本的接种从严重污染的临床标本中分离病源性真菌，取0.5～1ml临床标本注入小鼠腹腔内，每周处死1只，观察5～6周。取肝、脾、肾和脑组织做病理切片和真菌培养。
4.接种方法接种的部位和途径因研究目的不同而异。常用的接种部位有皮肤、皮下、口、胃、嗉囊、气管内、静脉、心内、阴道内、脑池、筛骨内。可根据不同的部位选择接种途径。皮肤接种常用于皮肤癣菌的接种。先将局部毛剃去，洗净，乙醇消毒；再用纱布擦皮肤数下，以不出血为度，然后涂上菌液。啮齿类静脉接种常选用鼠尾静脉，接种量0.2ml。兔选择耳缘静脉，每次接种量为2ml。腹腔注射常选用小鼠、豚鼠和兔，小鼠接种量为0.5ml，豚鼠1～2ml，兔为2ml或更多。颅内注射常选用小鼠，接种量少于0.1ml。睾丸接种常选用豚鼠，将睾丸自腹腔挤入阴囊中，抓紧睾丸，局部消毒后注入0.1～0.2ml接种液于一侧睾丸中。
5.感染后的处理动物接种后应标明接种的菌种名称、接种量、接种途径、接种日期和编号。接种动物应严加隔离，包括大、小便的严格管理。接种后要定期观察至少4周，注意动物生活习惯的改变及症状与体征的出现，每周处死1只，并做好观察记录。
所有死亡动物都应立即剖检，观察期间仍存活的动物应麻醉后处死。解剖时应无菌操作。常规检查的标本为肝、脾、肾和肺，也可根据需要选取其他的器官。采取的组织和器官应进行直接检查、组织真菌培养和组织病理检查，需要时应做特殊染色。所有使用过的手术器械、用具等均应置于消毒液中浸泡过夜，再清洗或在使用后直接高压消毒。解剖后的动物尸体应高压灭菌处理。
三、动物感染寄生虫的实验方法
动物感染寄生虫实验主要用于：①人体寄生虫学研究；②进行人畜共患寄生虫病的临床医学研究；③寄生虫保种。感染方法如下。
（一）溶组织内阿米巴
1.动物2～4个月龄犬或猫，25～35g小鼠，或200～300g大鼠。
2.寄生虫样品用水洗沉淀法（或离心沉淀法）收集患者粪便中的溶组织阿米巴包囊，吸取沉淀物加卢戈碘液（碘：碘化钾：蒸馏水为1：2：20）镜检。发现包囊即可备用。
3.感染方法
（1）选用健康的犬、猫或2月龄的大鼠，将沉淀法获得的大量包囊拌入食物中饲喂（饲喂前使动物处在饥饿状态）而致感染。
（2）选用健康的25～35g的小鼠或200～300g的大鼠用盲肠内注射法感染。将动物仰卧固定，乙醚麻醉，以无菌操作在腹左侧做约0.5cm的一个切口，用8号针头吸取经36～48h培养的溶组织内阿米巴滋养体0.3～0.5ml，（2～5）×105注入盲肠内，缝合腹壁。
4.结果检查经口饲喂包囊的动物1～2周后，盲肠内注射包囊感染的动物5～7天，即可镜检粪便。必要时解剖动物，肉眼观察肠壁病灶，同时用病灶局部肠壁黏液做涂片镜检滋养体。计算方法：1ml含原虫数=1ml滴数×1滴的视野数×1个视野数。
（二）疟原虫
1.动物选择体重18～22g的健康小鼠。
2.寄生虫样品准备用在红细胞内期的疟原虫感染动物。可对种源鼠剪尾、摘除眼球或心脏穿刺取血，选薄血膜镜检每10个视野可见1～2个配子体，感染率在10%～20%的种源鼠作供血鼠。将含有疟原虫的血液用枸橼酸钠（2%）生理盐水抗凝并稀释成淡红色血悬液备用。也可用疟原虫的子孢子感染动物。
3.感染方法
（1）血液感染用无菌的卡介苗注射器（1ml）吸取含有疟原虫的经抗凝稀释后的血液0.2ml注入实验小鼠的腹腔即可。
（2）蚊虫传染取实验小鼠仰卧固定，腹部去毛，置入饲蚊笼内供饥饿24h的阳性蚊虫叮刺1h，疟原虫的子孢子会通过蚊刺吸式口器从涎腺进入小鼠体内。也可用阳性蚊虫的涎腺经研磨、离心处理后的上清液，立即取0.2ml注入小鼠尾静脉或腹腔内，每25只蚊子可感染100只小鼠。
4.结果检查小鼠感染3～4天后，剪尾采血涂片，经瑞氏染色用油镜查找疟原虫。
（三）血吸虫
1.动物选用2kg以上健康家兔、20g左右的小鼠或1kg以上的豚鼠。
2.寄生虫样本取容器一只或数支放入数只阳性钉螺，注入脱氨水至容器的2/3处，置于室温25℃左右有阳光的环境或25℃温箱内，经4～12h尾蚴可陆续从钉螺体逸出，并浮于水面。容器内加网罩防止钉螺爬出丢失及污染容器。在解剖镜下用毛细滴管或细菌接种环吸或钓取尾蚴，经计数后置盖玻片上（18mm×18mm）备用。
3.感染方法仰卧固定动物，腹部去毛5cm×5cm，用75%乙醇棉球消毒，夹取含有尾蚴的盖玻片覆盖于动物皮肤表面，维持室温25℃左右，并顺盖玻片缘滴于一小滴温水使盖玻片与动物皮肤之间保持湿润。经15～20min移去盖玻片，可见动物局部皮肤有针头大小的充血点，此乃尾蚴钻入皮肤所致的皮肤炎症反应。一般兔感染150条左右，小鼠35条左右，或者根据实验要求酌情增减感染尾蚴的数量。
4.结果检查动物自感染后35～40天即可在粪便中镜检到血吸虫卵。通常用水洗沉淀法浓集虫卵方法检查。
