第二节 转基因动物
一、转基因动物的发展现状及应用前景
众所周知，21世纪将是生命科学的世纪，有人预测：转基因动物+生物反应器+克隆技术，将在下世纪的国民经济中占重要地位。
转基因动物技术是用实验的方法将外源基因导入动物组织细胞的基因组内而改变动物遗传性状的技术。在转基因动物制备过程中，可表达的目的基因前加上乳蛋白启动子，转基因动物的乳腺就成为一个生物发生器，目的基因的产物可以从动物的乳汁提取。目前已有的转基因产品，如人凝血因子、尿激酶、白介素、干扰素等。应用转基因动物加生物反应器来生产医用多肽或蛋白其效率远远高于传统的遗传工程。
克隆动物技术是将动物卵细胞的遗传物质吸出，将高度分化的体细胞的核注入到受体卵球细胞内，经过融合、去极化形成全能细胞，发育成动物个体的单性生殖技术。
这几项技术联合起来将给世界经济带来不可估量的效益。
转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，它的特点可以用“分子及细胞水平操作，组织及整体水平表达”这样一句话来概括。它的意义在于克服了动物种间的生殖隔离状态，实现了遗传物质的交换和重组，为我们进行生命科学研究提供了新手段，扩大了新视野。
转基因动物发展的历史虽然不长，1980年，Gordon等人首先报道了用显微注射纯化DNA的方法，获得了转基因小鼠。在此后的一年时间内，有6个实验室陆续报道通过向原核期的小鼠胚胎显微注射DNA，获得了转基因小鼠。但是，在这些早期的实验中，使用的基因结构未曾认真地设计和构建，大多是使用容易得到的材料进行实验，实验结果仅仅表明使用DNA显微注射的方法可以将外源基因导入小鼠种系之中。至于被导入的基因有何生理作用，则不能够检测出来。真正发生重大影响的是1982年Brinster和Palmiter合作生产的超级小白鼠。它们建立了MT启动子驱动大鼠GH基因编码序列的基因表达结构。实验结果证明，含有外源GH基因的小鼠长得比正常小鼠几乎大一倍。此结果引起整个生物学界的轰动。到目前为止，已建立起来的转基因动物有转基因小鼠、大鼠，鸡、兔、鱼、猪、羊、牛等。主要用于基因的表达调控研究、人类疾病的转基因模型、基因治疗、动物品种的改良及基因产品的制备。总之，转基因动物研究已经成为当前生物高科技研究的热点，它不仅为人们研究生命科学提供了更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将渗透到医疗、农产品、畜产品、食品中，人们在日常生活中就能感受到它的无处不在。
二、转基因动物的概念和基本原理
转基因动物（transgenic animal）是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因被称为转基因（transgene）。
当制备转基因动物时，外源基因可能只整合到动物的部分组织细胞的基因组中，也可能整合到动物的所有组织细胞的基因组中，我们把只有部分组织细胞中整合有外源基因的动物称嵌合体动物（chimera）。
逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。
嵌合体动物和转基因动物的相同点是它们染色体基因组内都整合有外源基因。不同点：转基因动物所有组织细胞基因组中均整合有外源基因，嵌合体只是部分组织细胞内；转基因动物能将外源基因遗传给子代，嵌合体只有当外源基因整合入生殖细胞时才能遗传；外源基因的整合发生在第一次卵裂以前则动物所有组织细胞中都整合有外源基因，若发生在第一次卵裂后则得到嵌合体动物。
转基因动物的基本原理是将改建后的目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（fertilized eggs）（或着床前胚胎细胞），然后将此受精卵（或着床前胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（oviduct）（子宫）中，使其发育成携带有外源基因（foreign gene）的转基因动物，人们可以通过分析转基因和转基因动物表型的关系，从而揭示外源基因的功能，也可以通过转入目的基因培育品种优良的工程动物。
三、转基因动物的构建
（一）外源基因（foreign gene）的制备
制备转基因动物首先要有目的基因，它可以是：预先分离的某一基因；逆转录法得到的cDNA；人工合成的DNA片段；含有目的基因的供体细胞基因组DNA。
通常将拟导入的目的基因在载体质粒上制成克隆，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒；分离纯化重组质粒，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段，最后将线状或环状重组DNA分别溶入无菌生理盐水，浓度为50～100μg/ml，-20℃储存备用。
目的基因直接导入受体细胞，往往不能表达或表达能力较差，必须经过改建。一般来说成为转基因的外源基因至少应包括两部分，即调控元件（regulatory element）和结构基因（structural gene）。有时为了检测方便还需要加上一个报告序列（report sequence）
（二）实验动物（laboratory animal）的准备
1.供体动物转基因研究中提供受精卵的雌性动物，一般有种系要求，若无遗传背景的特殊要求可选用F1动物。以小鼠为例：可选用4～6周龄的雌鼠用PMS和HCG做超排卵处理，注射间隔42～48h，第二次注射后让雌鼠与正常雄种鼠合笼，次日选有阴道栓的雌鼠，处死后立即取出输卵管，在解剖镜下冲出受精卵。超排好的小鼠每次能冲取20～30个卵。
2.与卵供体动物交配的正常雄性动物选择与卵供体动物同种系的繁殖力较强的雄性个体。以小鼠为例，6～8周龄性成熟，使用8～10个月需更换种鼠。
3.雄性不育动物输精管结扎的雄性，具有正常的交配能力，但精液中无精子，和雌性交配后，雌性呈假孕状态。以小鼠为例：选择性成熟的雄鼠实施双侧输精管结扎术，2～3周后经检验能使雌鼠怀孕但不产仔者。
4.受体动物接受转基因后的受精卵或早期胚胎，使之在体内发育、分娩的雌性动物。
以小鼠为例：选6周到5个月龄的雌性个体与不育雄鼠交配（与卵供体动物同步），选择有阴道栓的动物用于卵或胚胎移植。
四、基因导入技术
转基因动物技术目前常用的方法主要有显微注射技术、胚胎干细胞技术、逆转录病毒载体技术、精子载体技术和YAC法等。
（一）显微注射法
哺乳动物个体是从最原始的受精卵发育而来，采用显微注射仪直接将外源基因导入受精卵，再移植到受体动物，使其发育成转基因动物，称为显微注射法。显微注射仪主要包括一个倒置显微镜和微操纵臂。输卵管固定受精卵，注射器吸取外源DNA注入受精卵的雄前核内。这种方法由于基因整合多发生在卵裂之前，较少产生嵌合体，有利于对当代转基因的表达分析，并能快速建立转基因品系。这是目前制备转基因动物应用最多、最有效的方法。当外源基因的整合发生在受精卵第一次分裂之后则产生嵌合体动物（20%）。
1.优点①外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高；②以此种方法导入外源基因时，无须载体；③60%～80%的转基因子代鼠中，外源基因分布在所有的组织和细胞中；④导入的外源基因可长达50kb。
2.缺点①外源基因的整合是随机的，整合率不能控制；②有些动物的原核看不清楚，如猪、山羊等，须经特殊处理，才能有效导入；③需要较精密的仪器，费用昂贵。
（二）逆转录病毒载体法
逆转录病毒的cDNA具有能整合到宿主细胞染色体内的特点，以逆转录病毒为载体，通过转染的方式实现外源基因的转移称逆转录病毒感染法。这种方法操作简单，不需要显微操作仪。但逆转录病毒载体的构建较复杂，容纳外源基因的量有限，获得的第一代动物均为嵌合体动物，而且病毒载体序列可能干扰目的基因的表达。
1.优点转基因效率高，单位点、单拷贝整合，易分析插入位点，鸟类的卵在产出后已发育到桑葚胚期，不可能进行显微注射，而逆转录病毒载体对多细胞胚的转化十分方便，因此在培养转基因禽类研究中应用很广泛。
2.缺点随机整合，携带外源DNA片段大小受限，一般小于10kb，易产生嵌合体（mosaic），实验周期长；有安全隐患，有可能因DNA重组产生活病毒。
（三）胚胎干细胞介导法
哺乳动物囊胚期的内细胞团含有一些未分化的细胞，这些具有发育全能性的细胞在体外培养建株后称为胚胎干细胞（embryonic stem cell 简称ESC或ES细胞），用重组的逆转录病毒作载体感染ES细胞，再将此ES细胞移植入受体动物的囊胚腔内，可产生嵌合体动物，如果转化的ES细胞参与生殖细胞的建立，就可以进一步建立转基因动物。这种转基因方法称为胚胎干细胞介导法。它产生的第一代动物全部是嵌合体动物。
优点：ES细胞可进行体外培养，对ES细胞的遗传操作就变得相对简单。
目前ES细胞的建立和应用只在小鼠取得了成功，其他仅有一些报道。
（四）精子载体法
将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵的方法称为精子载体法。优点是成本低。缺点是结果不稳定，目前方法体系还未完全建立。
有人曾将兔的精子与氚标记的SV40病毒DNA共培养，结果在精子头部检测到放射性，这些精子受精后在2细胞期仍具放射性，证实精子具有捕获外源DNA的能力，并通过受精过程导入了受精卵。1989年Lavitrano等人报道，用此法建了转基因鼠，立即引起各国科学家的兴趣，这种方法如果可行，通过人工授精的途径来制备转基因大家畜（受精卵不透明）将大大降低成本。随后有8个研究小组用同样的方法制备了1300只小鼠无一携带外源DNA，因此这种方法还没有被广泛接受，但仍有不少人在进行这方面的尝试，处在完善和发展阶段。
（五）YAC法
利用酵母人工染色体（YAC）作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（YAC）载体是近年来发展起来的新型载体，能克隆百万对碱基的大片段DNA。
优点：保证了大片段DNA的完整性，提高了较长外源片段在转基因动物研究中的整合率，保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。
因此YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。
除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如诱变技术（P265）等，这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。几种基因导入方法的比较参。
原核注射精子载体核移植逆转录病毒基因准备易易中等难基因大小中等无限制无限制小定点整合有可能不可能有可能不可能技术要求高低高低胚胎存活中等中等低高阳性率1%～10%20%100%约100%
五、胚胎的移植
胚胎移植是将导入外源基因的受精卵（胚胎）移植到受体动物的输卵管或子宫中，使其正常发育、分娩，得到携带外源基因的亲本个体。以小鼠为例，注射有外源基因的单细胞至桑葚胚期的卵移植到假孕0.5天的雌鼠输卵管内，输卵管移植要求卵有透明带包裹。注射后3.5天的囊胚移植到假孕2.5天的雌鼠子宫内，子宫移植不需透明带。
上述方法转移未注射卵，其中50%～75%可发育成胎鼠，而转移注射过的卵发育成胎鼠的占10%～30%。所以最好给每只假孕雌鼠转移20～30个已注射卵，每胎可产5～7个仔。
六、转基因动物的鉴定
假孕动物经过受精卵或胚胎移植后，精心饲养、分娩后取动物组织（尾尖、耳尖），提取基因组DNA，用点杂交、Southern杂交和PCR等方法（确定转基因是否整合以及整合的拷贝数等）来鉴别目的鼠的基因组DNA中是否含有外源基因。还可以用染色体原位杂交技术检测整合的位点。通过鉴定确定首建转基因动物，再经过子代检测建立转基因种系。
一般PCR方法简单快捷，但由于其高度敏感，DNA样品的微量污染便可导致假阳性，因此PCR阳性的样品常通过Southern杂交重新检测。
七、转基因动物的建系及命名
首建转基因动物确定后，即用之交配繁殖，以建立转基因鼠系，大部分首建者的下一代50%含外源基因，20%为嵌合体，还有一部分不育。若首建者为近交系产生，可用相同种系交配，以维持其遗传背景，首建者来源于非近交系，则可用F1动物与首建者交配繁殖。
转基因动物的名称一般包括：构建转基因动物的方法、外源基因的特性及构建实验室等信息。
形式如下：TgX（YYYY）#####Z z z。
Tg 是Transgene 的宿写，X 代表DNA的插入方式（一般用N表示非同源插入，H代表同源重组，R代表逆转录病毒感染）；YYYY 是插入序列指示，一般由8个以内字符表示，（如Ins1鼠胰岛素基因）已命名的基因序列要采用标准基因符号（命名时可查基因数据库）；#####实验室指定的序号，转基因动物被证实后，实验室指定的独特号码，至多可用5个字符（数字）；Z z z 实验室密码，指定给每个制备转基因动物实验室的代号。转基因动物遗传背景为单一品系的，还要在转基因符号前加上动物品系名称。如：C57BL/6J-TgN（GPDH）23Jwg表示GPDH（人甘油磷酸盐脱氢酶）基因非同源插入C57BL/6J小鼠染色体内，由Jon W·Gordon实验室筛选出的第23号动物。
八、转基因动物研究出现的问题
1.制作转基因动物效率极低这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约这项技术广泛应用的关键。总体上讲，实验动物转基因阳性率高于大家畜。以显微注射法产生转基因动物为例，一则统计资料表明，小鼠转基因阳性率为2.6%，大鼠为4.4%，兔为1.5%，牛为0.7%，猪为0.9%，绵羊为0.9%。在这个问题上我们认为显微注射造成胚胎的机械损伤导致胚胎死亡是其中一个极其重要的原因。
2.外源基因在宿主基因组中的行为难以控制转基因随机整合于动物的基因组中，很有可能引起宿主细胞染色体的插入突变，还可造成插入位点的基因片段的丢失及插入位点的基因的位移，同时也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。
3.转基因表达水平低，而极少部分转基因表达水平过高许多转基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低，极少部分表达水平过高。大部分转基因（尤其是cDNA）表达水平低得难以检测，而个别转基因的表达水平又太高。如Wright等制作的转ha1-AT基因绵羊，其中一只转基因羊在产羔后泌乳时，乳汁中ha1-AT的水平高达60g/L，泌乳中期乳汁的ha1-AT水平仍维持在35g/L，外源基因的这种高水平表达是宿主动物难以承受的。
4.阳性转基因动物筛选不易由于大动物的妊娠期较长，所育子代数目有限，所以给筛选带来很大的困难。现在，一般采用PCR法和Southern杂交法对含有外源DNA的受精卵进行整合率的检测。
5.一些环境和社会安全问题通过人工对生物甚至人的基因进行相互转移，转基因生物已经突破了传统的界、门的概念，具有普通物种不具备的优势特征，通过基因漂移，会破坏野生近缘种的遗传多样性。另外，对人体健康也有威胁和影响，如转入的生长激素类基因就有可能对人体生长发育产生重大影响。为了预防和控制转基因生物可能产生的不利影响，联合国于2000年通过了《卡塔赫纳生物安全议定书》。
九、转基因动物的应用
1.在病毒性疾病研究中的应用主要有以下几个方面：将病毒的全基因组DNA导入小鼠基因组，这种小鼠不仅具有表达病毒蛋白的能力，还能进行病毒DNA复制。目前已制备成功的有AIDS病毒、乙型肝炎病毒和人白细胞白血病Ⅰ型病毒的小鼠模型。它们在发病机制的探讨和治疗药物的筛选等方面具有重要价值。另外，转基因技术还能使人们更详细地了解和剖析病毒的某些调控元件或单一基因的功能，为病毒性疾病的研究提供了广阔的前景。
2.在遗传病学研究中的应用转基因动物在遗传学中具有重要作用，采用转基因技术，可以人为定向地改变小鼠基因组中的某个特定基因，也可以人为地加入一个或多个外源基因。主要用于建立遗传病动物模型，研究单个基因在遗传病中的作用。还可以研究药物干预后动物的反应机制等。目前用于遗传病研究的转基因动物模型主要有家族性高胆固醇血症、镰刀状细胞贫血、囊性纤维化及腺苷脱氨酶缺乏症等。
3.在免疫学研究中的应用转基因动物技术对于探索免疫潜能细胞的发生和体内调节是一非常有用的工具，免疫球蛋白基因在转基因鼠中可被表达，充分显示了转基因技术在富含特定抗体的B细胞种群研究中的作用。此外，转基因动物技术在免疫球蛋白的多样性，即免疫球蛋白基因的重排方面具有独特的优点，是其他任何实验方法所不及的。
4.基因治疗是通过改变患者遗传物质从而达到治疗疾病的一种方法。转基因动物的发现，可能使人类在同疾病的斗争中获得一种新的武器。改变患者细胞遗传物质的主要途径有：①引入功能正常的基因；②置换致病基因；③修饰致病基因。基因治疗的方式包括体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗2种。前者不能根治疾病，后者在生物发育的胚胎期开始对其遗传物质进行修饰，从而达到校正和治疗的目的。这种技术目前未用于人类，但已广泛应用于动物疾病的基因治疗，包括生殖系统、心血管疾病、肌营养不良等。如有一种近亲繁殖的侏儒小鼠，体内缺乏生长激素，已经通过受精卵注射技术使这种基因缺陷得到纠正，恢复了它们的正常生长。
5.在改良和培育动物新品种方面的应用人类早就应用物种选择方法培育动植物新品种，但这种经典的育种方法常受到限制，随着转基因动物的出现，人们意识到通过体外重组代表优良性状的基因新品种方面的巨大潜力。改良的目的是增加动物新的遗传品质，如瘦肉率、高生长率、抗病力等。现已采用该技术培育出许多动物新品种。如美国培育的转基因鲤鱼可增产20%～40%，并已进行室外放养。我国应用转基因技术已培育出个体大的金鱼、鲤鱼等。
6.基因产品的制备转基因动物为基因产品的大量制备提供了新的手段，这种转基因动物又称为动物生物反应器，其原理是将具有生物活性的蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，培养成转基因动物，使外源基因在动物体中高效表达，然后再分离提取目的基因产物。目前，用转基因动物生产外源基因产品多数尚属试验阶段，一些具有重要的医学价值的生物活性蛋白如干扰素、牛乳清蛋白、尿激酶等已用转基因动物生产，为大规模生产提供了宝贵的经验。如在转基因山羊中生产溶纤维蛋白原激活因子，只要培养出3000头，即可供应全世界心脏病人使用，如用奶牛表达，几十头即可。
综上所述，转基因技术的应用已从实验室走向社会，相信在不久的将来，转基因动物将更好地为人类造福。
第三节 克隆动物与克隆技术的应用
克隆是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。①在分子水平，克隆一般指DNA克隆（也叫分子克隆），含义是将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体（如质粒和病毒等）中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。②在细胞水平，克隆实质为由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体，其中每个细胞的基因都相同，比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆；又如，在脊椎动物体内，当有外源物（如细菌或病毒）侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体，产生该抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式——无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性，生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。③在个体水平，克隆是指由基因型完全相同的2个或更多的个体组成的一个群体。比如，2个同卵双胞胎即为一个克隆，因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。另外，克隆也可以作动词用，意思是指获得DNA、细胞或个体群体的过程。克隆动物，就是指通过无性繁殖以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的群体。如用未分化的胚胎细胞进行核移植称为胚胎细胞克隆（embryoniccillcloning）；用已分化的体细胞（即非生殖细胞）进行核移植称为体细胞克隆（somaticcellcloning）。无性繁殖不需要经过受精过程，这在植物中很常见，例如，将某些植物（柳树、马铃薯）的某一部分（根、茎）切成几块或几段，分别栽到土壤中，每一段或块在适当条件下均能长成为一个完整个体。而在高等动物，这简直是不可想像的，直到诞生了那只轰动世界的克隆绵羊“多莉”（Dolly）。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎。当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。
哺乳动物的体细胞以及生殖原细胞一般含有成对数目的染色体称为二倍体。生殖原细胞先经有丝分裂增殖形成生殖细胞，再经过减数分裂形成配子（精子和卵子），配子细胞的染色体只是体细胞的一半，称为单倍体。单倍体的精子和卵子结合（即受精），重新成为二倍体的受精卵（合子），才能继续发育，这种繁殖方式称为“有性繁殖”，它是自然界高等动、植物最基本的遗传和繁殖方式。
一、克隆动物的发展概况
（一）克隆动物的发展史
早在1934年人们对单细胞有机体克隆已取得成功。1938年，德国科学家Spemman提出了将胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中的构想。1952年，英国的Briggs和King利用蛙原肠胚以前的细胞核与去核蛙卵构建的重构胚克隆获得了成蛙；同时，他们还发现其原肠以后的细胞只能支持重构胚发育到一定程度，并据此认为胚胎细胞发育的能力，会随着胚胎的发育逐步下降。1962年，英国剑桥大学的Gurdon将已分化的蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核蛙卵，结果产生了具有生殖能力的蛙，证明蝌蚪的体细胞仍具有发育的全能性。以后，各国科学家对克隆动物做了大量的研究，主要经历了以下3个阶段。
1.胚胎细胞克隆阶段1981年，lllmensee和Hoppe报道他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为供核体，直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中，重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫，获得了克隆小鼠，这是在哺乳类动物第一次用胚胎细胞进行核移植获得成功，但别的实验室一直无法重复此项实验。1983年，美国科学家利用核移植技术，结合细胞融合方法获得了克隆小鼠，此项工作真正拉开了哺乳动物克隆的序幕。1986年，英国的Willadsen用绵羊的8～16细胞阶段的胚胎细胞作供体进行核移植，首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后，其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。以上这些克隆实验中所用供核细胞均属发育至不同阶段的胚胎细胞。
2.同种体细胞克隆阶段1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉”。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞，是生物技术史上具有划时代意义的重大突破，是克隆技术的一个里程碑，也改写了部分生物学的理论。1998年5月，美国科学家Robl的研究组利用胎仔成纤维细胞克隆出了3头牛，而且携带了转移的基因。1998年7月，日本科学家Dato等用牛的输卵管细胞克隆出了8头小牛。1999年6月，Yanagimachi的研究小组利用成年雄性小鼠尾尖的成纤维细胞为供核体细胞，成功地克隆出了一只雄性小鼠，这也是第一只供核体细胞不是来源于雌性动物被克隆的动物。此后，同种体细胞克隆山羊、猪、猫和兔也都相继诞生。我国在体细胞克隆山羊和克隆牛的研究中，不论雌的还是雄的也都已获得成功。同种体细胞克隆所用供核体细胞，一般为高度分化的体细胞。
3.异种体细胞克隆阶段异种体细胞克隆是将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。由于濒危物种的个体数量少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，这就促使科学家提出了异种克隆的设想。异种克隆研究面临着许多问题，如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育，异种核质能否相容，异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。这些问题的探讨有利于充实细胞生物学、发育生物学、生殖生物学、免疫学和信号转导等研究领域的理论。
我国克隆动物研究近几十年来取得了很大的成绩。20世纪60年代，生物学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。1990年5月，西北农业大学畜牧所克隆山羊成功。1992年，江苏农科院克隆一只兔。1993年，中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院合作，克隆一只山羊。1995年7月，华南师范大学与广西农业大学合作，克隆一头奶牛、黄牛的杂种牛。1995年10月，西北农业大学畜牧所克隆6头猪。1996年12月，湖南医科大学人类生殖工程研究室克隆6只老鼠，中国农科院畜牧所克隆一头公牛犊。1999年6月，中国科学院动物研究所研究员陈大元率领的研究小组，通过将大熊猫体细胞植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大熊猫的早期胚胎。同年10月，中科院动物研究所和福州大熊猫研究中心合作，首次培植成功异种克隆大熊猫早期胚胎，这表明我国的大熊猫研究再次走到世界前列。2000年5月，我国科技人员利用胚胎克隆出2只小白兔。2000年6月，西北农林科技大学生物工程研究所培育出世界上第一例成年体细胞克隆山羊。
（二）克隆动物的研究现状
体细胞克隆经过几年的发展，已经诞生了多种哺乳动物的克隆后代。以下简要综述各种动物克隆的现状。
1.绵羊第一次用分化细胞做供体克隆成功的动物即为绵羊。1996年，Campbell等用体外培养的已发生分化的胎仔的胚盘细胞获得了克隆绵羊。这是动物克隆的重大突破，使人们相信分化一定程度的细胞可以去分化。1997年，来自乳腺细胞的克隆绵羊“Dolly”的诞生，实现了几代科学家的梦想，并直接推动了全球大规模的克隆研究的进程。同年，Schnieke等利用转基因技术，将Human Factor IX基因转染胎仔成纤维细胞，以此为供体得到了第一批携带外源基因的克隆绵羊。2000年，McCreath等利用基因打靶技术，得到定点整合外源基因的克隆绵羊。2002年，Loi等将颗粒细胞于55℃加热灭活，只将保持完整核小体结构的细胞核注入到去核卵母细胞中，最终得到来自灭活细胞的克隆绵羊。这一实验验证了核移植先驱Marie DiBerardino的理论：体细胞核移植的理想境界是只有DNA、蛋白质复合体及有功能的中心体被导入受体胞质。这是哺乳动物中首例支持这一说法的实验，为拯救濒危物种甚至复活已灭绝的物种展示了光明的前景。2001年，Loi等以绵羊卵母细胞为受体，经异种核移植，成功地得到了濒危的欧洲盘羊的克隆后代。
2.牛牛作为最常见、与人们生活密切相关的家畜，从一开始即受到克隆学家们的重视。目前得到的克隆牛已初具规模，早期的克隆牛已正常产仔。作为克隆研究的材料，牛有许多优点，如材料来源广、卵母细胞接受性强、研究成果可直接用于生产等，人们利用牛做了大量的理论及应用研究。1998年，Cibelli等利用体外培养的携带了外源基因的胎仔成纤维细胞，得到表达p-半乳糖苷酶的转基因牛。紧接着，日本得到了来自输卵管上皮细胞的克隆牛。此后，新西兰、法国、德国等都得到了克隆牛。我国的克隆牛实验也取得了很大进展。2001年，中国农业大学陈永福教授等将国外构建的克隆牛胚胎，移植入国内受体母牛，获得了克隆牛犊。2002年初，中科院动物所的陈大元研究员领导的实验小组与山东中大胚胎工程中心合作，获得首批来自成年牛耳成纤维细胞克隆牛，这是国内首次独立完成的克隆牛实验。迄今为止，已有胎仔成纤维细胞、耳成纤维细胞、颗粒细胞、肌细胞、乳腺上皮细胞、子宫上皮细胞、肝细胞、输卵管上皮细胞等用于克隆牛并取得了成功，克隆牛后代已初具规模。2001年，美国ACT公司对他们得到的24头克隆牛的近况做了报道：24头克隆牛已经性成熟，在遗传、免疫等方面未发现异常，且人工受孕成功。克隆牛中一个值得注意的现象是日本黑牛的克隆，其克隆效率高达19%，而其他的克隆牛效率不超过5%。分析发现该方法与其他克隆方法有所不同，在得到的38枚克隆囊胚中，他们只选择了其中的10枚移植入受体中，得到8头克隆小牛，存活4头。这就提出了一个问题，即是否可以通过选择胚胎来提高克隆效率。2001年，Urakawa等又报道了这种牛更高的核移植成功率。他们对95枚卵母细胞进行了核移植，其中27枚发育到致密桑葚胚。移植其中的6枚后，得到4头成活的克隆牛。照这样计算，若所有胚胎质量相同，将意味着19%的核移植卵母细胞可发育为克隆后代，这是目前其他动物无法实现的效率。这种高效率究竟是胚胎选择的结果还是物种的原因，现在仍不明朗。因此，阐明日本黑牛克隆高效率的原因将为提高动物克隆的效率提供有价值的信息。
3.小鼠小鼠因其生殖周期短，饲养空间小，材料来源较容易，因此成为最常用的实验动物。“Dolly”羊诞生以后，人们开始致力于小鼠的克隆。但小鼠的克隆方法却有别于绵羊。第一只克隆小鼠的核移植借助于一种压电装置的设备。1998年，Wakayama等报道了用此装置，借助瞬间高压，将卵丘细胞核迅速导入卵母细胞中，得到了第一批克隆小鼠。此后，用此方法得到了多批克隆小鼠。2000年，Ogura等用电融合的方法，将小鼠尾尖细胞导入卵母细胞中，得到了克隆后代，这突破了小鼠克隆的技术限制。2001年，Ono等以同步于M期的小鼠胎仔成纤维细胞为供体核，移植并在原核期将原核移入去核的受精卵中，得到了2个核移植后代。2002年，Hochedlinger等以B、T淋巴细胞为供体，得到克隆囊胚，经培养得到来自克隆胚胎的ES细胞，然后将此ES细胞注射入四倍体囊胚腔，得到来自B、T淋巴细胞的克隆后代，这是动物克隆中的重大事件，它有力地说明了终端分化细胞可以去分化，恢复全能性，也证实了克隆动物至少有一部分来自分化的体细胞。
4.猪猪是又一种重要的家畜，也是目前认为最适合用来生产用于移植的人类器官的动物。因此，对猪的克隆研究很早就已开展。但由于猪是多胎动物，每只受体需要移植多枚重构胚才能诱导妊娠，对克隆工作造成一定的困难。直到2000年，科学家们用不同的方法得到了三批克隆猪。Onishi等利用显微注射的方法，将胎仔成纤维细胞注射到卵母细胞中，经体内发育得到一头克隆小猪。Polejaeva等用2次连续核移植，得到5头小猪。这以后，猪成为研究动物克隆的重要模型。猪的器官被认为是有可能作为人类器官的代用品。因此，猪的克隆的应用研究很活跃。2001年，Park等报道，他们将携带有绿色荧光蛋白基因的皮肤成纤维细胞，导入去核卵母细胞中，得到了表达有绿色荧光蛋白的克隆猪胚胎。2002年，Lai等将绿色荧光蛋白基因导入胎仔成纤维细胞，并用G2/M期细胞做供体得到表达绿色荧光蛋白的克隆小猪。
5.山羊山羊的克隆成功较早。1999年，Baguisi等得到了表达人的antithrombin III基因的转基因克隆山羊。我国科学家于1999年得到了来自胎仔成纤维细胞的克隆山羊，随后又得到了两批来自卵丘细胞和胎仔成纤维细胞的克隆山羊。Keefer等也于2001年和2002年得到两批来自胎仔成纤维细胞和颗粒细胞的克隆山羊。
6.兔虽然第一只体细胞克隆兔于2002年诞生，但兔的克隆历史并不短。人们利用胚胎细胞为供体得到过克隆兔。1992年，Yang等以16～32细胞期的胚胎细胞为供体，得到克隆兔。2002年4月，Chesne等报道了体细胞克隆兔的成功。随后，Matsuda等用携带外源基因的体细胞为供体，得到转基因的克隆兔。
7.猫猫是一种不太常用的实验动物，对其生殖生理的研究不如其他动物充分，克隆猫的诞生比较晚。2002年，Shin等得到了来自卵丘细胞的克隆猫。这只猫的诞生并不顺利。他们先用雄性成纤维细胞为供体，得到188枚胚胎，将其中的86枚移植入受体，得到一例妊娠，但不久后停止发育。后来，又以卵丘细胞为供体得到了成活的克隆猫。但这只小猫在出生后2个月死亡。
二、克隆技术的原理和方法
目前哺乳动物的克隆方法主要有胚胎分割和细胞核移植2种。细胞核移植又包括胚胎细胞核移植、体细胞核移植、干细胞核移植等。
（一）胚胎分割
胚胎分割是把一个胚胎分成2组或多组，经过短暂培养使其修复、发育，再一同或分别移到不同的代母中妊娠产多仔，这种技术又称为人工同卵多胎技术。这是一项成倍或数倍地增长经济遗传性状优秀动物的数量和迅速提高畜禽生产质量的技术。应用这项技术可以人为地把胚胎分割成2个或几个，移植给受体动物，可获得一卵双胎甚至多胎，比起移植未分割的整胚，产仔率可大大提高。胚胎分割技术可以对遗传学、发育生物学、营养学、生理学以及动物育种学等研究提供非常宝贵的材料。人们可以不用考虑遗传背景去研究各种因素对动物的影响。胚胎分割是胚胎移植中扩大胚胎来源的一个重要途径。目前已被用于产生许多同卵双生后代。分割后的2枚半胚，即使性别不明，也可移植给同1只受体动物，而不会产生异性孪生母犊不育的问题。在我国胚胎分割成功的有：小鼠（1986年，西北农业大学），奶牛（1987年，中科院遗传所、四川凤凰山乳牛场），山羊（1987年，西北农业大学），绵羊（1987年，中科院畜牧所），兔（1990年，西北大学、中科院发育所）。
胚胎分割有2种方法，一种是用显微操作仪上的玻璃针（或刀片），将每个卵裂球分离或半胚进行切割，分别放入一空的透明带中，然后进行移植。1979年，英国剑桥大学的威拉德森采用这种方法成功克隆出了4只羔羊。他先用吸管从卵裂球的中间将卵裂球吸住固定，再用特制的玻璃针刺破透明带，并插入其中，把胚胎推向一边，继续进针，直刺向被吸管吸住的透明带部位。接着挑开透明带，再用操作吸管取出裸露的胚胎，迅速放入培养皿中切割。在切割前，先用吸管反复抽吸、吹打裸露的卵裂球，使卵裂球内细胞间的内聚力逐渐减弱，使各个卵裂细胞松动。然后用一根玻璃针切割卵裂球，把完整的卵裂球分成2个半胚。当分割完成后，立即用注射吸管吸住空透明带，裂口处于垂直位置，把要注入的分割胚胎吸入注射吸管内，再把注射吸管的前端插入裂口内，并把分割胚胎分别放入透明带中，用琼脂把分割胚胎包埋2次。最后，威拉德森还得为这样处理过的胚胎请“临时保姆”，他先把这种胚胎放入家兔的输卵管内，由于停留时间过长，使得胚胎的活力减弱，最后还是请绵羊做“临时保姆”，直到分割胚胎顺利地发育到囊胚期，再将它移入“代理母亲”的体内，如果胚胎发育正常，这位“代理母亲”便可以临产分娩了，诞生的便是由胚胎细胞克隆而生的动物。另一种方法是用显微操作仪上的玻璃针（或刀片）或徒手持玻璃针将桑葚胚或囊胚一分为二或一分为四，并把每块细胞团移入空的透明带内，进行移植。目前也可不装入透明带中，直接进行移植。
