（二）细胞核移植
细胞核移植技术是目前成功的进行无性繁殖的技术。它的基本原理是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。前者为供体，可以是胚胎的干细胞核，也可以是体细胞的核。受体大多是动物的卵子。因卵子的体积较大，操作容易，而且通过发育，可以把特征表现出来，因此细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中，细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系，探讨有关遗传，发育和细胞分化等方面的一些基本理论问题。该技术已有几十年的历史。1952年，Briggs和King在两栖类动物中首次获得核移植成功，使得发育生物学上的几个根本问题得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮细胞等体细胞的核做移植，确立了已经分化的细胞核可以正常发育的事实。我国胚胎学家童第周先生等在鱼类细胞核移植方面做了许多工作。他们在1976年首次获得的鲤鲫移核鱼，不仅有理论意义，而且也为鱼类育种开辟了一条新的途径。
哺乳动物的细胞核移植也早已引起关注，因哺乳类受精卵极小，体外培养和细胞核移植技术难度大，因此直到1981年lllmensee和Hoppe才首次报道获得成功。Mcgrath和Solter在1983年发表了用核移植技术与细胞融合相配合的方法，能将90%以上的移核卵培养到胚泡期。经过胚胎移植，均可获得一定比例的核移植小鼠。
1.胚胎细胞核移植用显微注射的方法分离尚未着床的早期胚胎细胞（分裂球），将其单个细胞导入去除细胞核的未受精的成熟的卵母细胞，经过点融合，将该卵母细胞胞质和导入的胚胎细胞核融合、分裂、发育成胚胎。把该胚胎移植给受体，继而妊娠产仔。1986年，Willadsen将8和16细胞期绵羊胚胎的卵裂球与去核卵母细胞融合，再移植到结扎母羊的输卵管中，获得了3只克隆羊羔。1987年，Tsunoda等将4和8细胞胚的细胞核移入2细胞去核胚，产生了克隆鼠。从此以后，世界上相继获得了克隆绵羊、克隆牛、克隆兔、克隆猴等。1996年，我国首批克隆小鼠在湖南医科大学诞生。该校卢光秀教授指导研究生用胚胎细胞核移植方法克隆L5黑毛小鼠。实验如下：①从昆明小鼠输卵管中取出成熟卵母细胞，去其细胞核；②从L5黑毛小鼠2～8细胞胚中取单个卵裂球，将其细胞核移入昆明鼠去核卵母细胞；③将移核后的胚胎移植到昆明鼠输卵管中，孕育20天，实验获得6只L5黑毛克隆小鼠。
2.体细胞核移植1997年2月27日，英国爱丁堡罗斯林（Roslin）研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”（Dolly）诞生，这一消息立刻轰动了全世界。“多莉”的产生与3只母羊有关。一只是怀孕3个月的芬兰多塞特母绵羊，2只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞，另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下：从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。
一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞（围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞）的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中，得到20多只发育完全的小鼠。在克隆小鼠中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态，然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体，经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10～12μm的卵丘细胞用做细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3h内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用做细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3～6次）。卵母细胞（一般处于减数分裂中期II）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7μm的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5min 之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1～6h，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎仔鼠在大约19天后通过手术取出。
较胚胎克隆而言，体细胞克隆有着重要的生物学意义。胚胎细胞是一个没有分化的细胞，如受精卵变成2细胞、4细胞、8细胞等，甚至到囊胚里边的内细胞团细胞。到原肠胚以后，它们将分成三胚层，即外胚层、中胚层、内胚层。外胚层就演化成为皮肤等，内胚层就演化成为消化道上皮等，中胚层演化成骨骼、肌肉和结缔组织，这些组织的细胞为分化的细胞。胚胎细胞是没有分化的，克隆比较容易。体细胞是高度分化的，可是现在就用这样的体细胞来克隆照样也能够恢复全能性，恢复到胚胎细胞具有的功能。就是在卵子里面有一些去分化因子，能够使进去的高度分化的体细胞核去分化、重新程序化变成一个与胚胎细胞一样的全能性的细胞。所以它能继续发育分化成2细胞、4细胞和8细胞。与正常的胚胎发育一样，发育成囊胚，然后移植到受体子宫里去。所以体细胞克隆的意义就在于它是生物学的基础理论上的一场革命，因为高度分化的细胞的很多基因是关闭的，现在放到卵子里能够获得全能性，也就是说基因被重新打开了。
3.干细胞核移植干细胞是人体内最原始的细胞，它具有较强的再生能力，在干细胞因子和多种白细胞介素的联合作用下可扩增出各类的细胞。在1999年末的年度世界十大科技成果评选中，“干细胞研究的新发现”荣登榜首。干细胞研究有不可估量的医学价值。分离、保存并在体外人工大量培养使之成长为各种组织和器官，成为干细胞研究的首要课题。目前，干细胞的分离和培养技术获得了重大进展，利用单克隆免疫吸附能识别细胞类型或细胞谱系的表面抗原，其分离纯度和细胞活力都很高。1999年以色列魏茨曼科学院将白介素-6与干细胞内的受体分子合并研制出一种新分子，可使干细胞在维持原本特性的基础上进行自我增殖且细胞寿命也有所延长。在临床运用中，造血干细胞应用较早。在20世纪50年代，临床上就开始应用骨髓移植来治疗血液系统疾病。到80年代，外周血干细胞移植技术逐渐推广。美国Stmlells Csliifornia公司用血液干细胞在小鼠体内培育出成熟的肝细胞。目前干细胞主要指胚胎干细胞，它可以从早期胚胎胚泡的内细胞团或桑葚胚的原始生殖细胞中分离获得。研究证实，分离的小鼠胚胎干细胞在体外可以分化形成包括心肌细胞、造血干细胞和神经纤维细胞在内的各种细胞；将胚胎干细胞重新移入小鼠胚泡，可以参与形成嵌合体胚胎。说明胚胎干细胞具有发育的全能性。另外还发现，胚胎干细胞体外培养寿命比胎仔细胞和成体细胞要长。因此，胚胎干细胞是克隆哺乳动物供核细胞的最佳来源。有人利用胚胎干细胞克隆小鼠已经获得成功。1999年，Vogel将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将胚胎植入小鼠子宫中，获得了完全由胚胎干细胞发育来的克隆小鼠。我国于1995年分离出小鼠胚胎干细胞，并有嵌合体小鼠产生。
4.核移植法克隆哺乳动物的操作程序核移植技术经过多年的发展，已建立了一整套的程序，包括：供体细胞的准备、卵母细胞的采集、核的移植、重构胚的活化、重构胚的体外培养、移植等。对于不同的动物，程序中的某个环节的方法可能会有所不同；而同一物种，对程序中某一环节的改进有可能会提高实验效率。
（1）供体细胞的准备细胞核供体来源可以是胚胎卵裂球、胎仔成纤维细胞、乳腺细胞等。现在对干细胞的研究发现，干细胞（胚胎干细胞）可作为一种良好的细胞核供体。供体细胞所处细胞周期是影响克隆胚胎发育的关键因素，在体细胞克隆研究中使用的供体细胞主要还是自然停滞GO/G1期的细胞、血清饥饿控制的GO期细胞以及高度汇合生长发生接触抑制的细胞（此时的细胞绝大部分处于GO/G1期）。供体细胞的获得主要有2种方式：新鲜制备和体外培养。新鲜制备主要指采用刚从组织上分离不久，不经过体外培养的细胞直接用于核移植。体外培养获得供体细胞，主要是取所要克隆的某一组织的细胞，在体外进行原代及传代培养，得到贴壁细胞。于核移植前，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，得到悬浮细胞，用于核移植。目前的动物克隆多数采用体外培养的细胞。
（2）核移植受体细胞的准备过去曾用去核受精卵和去核2细胞胚为细胞质受体，现在多用去核卵母细胞。卵母细胞去核可用化学处理和紫外光灭活染色体的办法，但以显微手术法简便有效。通常借助显微操作仪，将成熟卵母细胞的极体及其下方的少量细胞质（包括卵母细胞中期染色体）吸出。卵母细胞的来源，多采用由卵巢排出或从输卵管回收MII期成熟卵母细胞。
（3）去核去核是指将受体卵母细胞的遗传物质去除，以接受外源的供体细胞核。完全去除受体卵母细胞的核遗传物质是进行哺乳动物克隆的前提。常用的去核方法有以下几种。
1）盲去法由于在普通光镜下无法直接观察到中期纺锤体和染色体，一般是根据第一极体的位置来确定MII期卵母细胞中染色体的位置，进行去核操作，即利用刚排除第一极体的卵母细胞，其纺锤体与第一极体还未完全分开或刚分开，此时第一极体的位置指示了纺锤体的位置。若用注射针吸取第一极体及其下方的1/4～1/3细胞质（含中期染色体），即可将卵母细胞核吸出。也可用固定针固定卵母细胞，使第一极体处于时钟12点的位置，用一根直径1～2μm的细针从第一极体刺穿透明带后将卵母细胞挑离固定针并在固定针下缘来回摩擦，使透明带破开一个小口，然后重新固定卵母细胞令破口处于时钟12点的位置，用一平口针在3点钟的位置挤压卵母细胞，将第一极体连同下方的胞质（含中期染色体）一起挤出。盲去法的优势是方便、快捷，可以降低体外操作的时间。但由于第一极体并非总是与卵母细胞内的染色体对位，随着培养时间延长，两者位置发生偏移，极体可在卵周隙中移动位置，不能准确指示核的位置，从而使去核率不能达到100%。
2）DNA荧光染料显示法用一种染料来显示卵子内的遗传物质无疑是一种最准确的去核方法。目前已有多种染料用于辅助去核。常用Hoechst染色去核法：有A、B、C三种方法。A法：使用含5～10μg/ml Hoechst33342的操作液在紫外光照射下，DNA显示蓝色，这样就可按常规操作除去中期卵母细胞的染色质，操作时间不应超过15s，以免伤害卵母细胞而影响重构胚的发育。同时在操作时应避免紫外光照射别的供体及卵母细胞。该法的优点是去核准确，效率较高，但要求技术熟练。B法：注射针在吸取第一极体及部分胞质后退出，紫外光下检查针管中是否有染色质。C法：用吸管除去连同极体在内的一半卵母细胞的胞质，并使其完整保留。然后打开紫外灯检查，收集无核的一半细胞用做受体。
3）蔗糖显示法Wang等在研究中发现，小鼠卵母细胞经含0.09M蔗糖的显微操作液室温处理10min后，在普通光镜下即可观察到卵母细胞边缘有突起，该突起之下即是与周围胞质明显不同的MII期纺锤体，吸取这部分胞质，检测发现去核率达100%。Liu等在牛的核移植实验中，对此方法做了修改。将蔗糖浓度升高到0.3M时，卵母细胞的纺锤体也形成透明突起，去核率达95%，且吸取的胞质很少。与对照相比，这种去核方法得到的重构胚的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无差异，说明这是一种安全的去核方法。
4）化学去核法利用某些化学试剂对卵母细胞进行处理，可准确去核。2000年，Baguisi 采用脱羰秋水仙碱处理小鼠卵母细胞可获54%的去核率。1993年，Fulka等用依托泊苷（etoposide）和放线菌酮（cycloheximide，CHX）处理MI期小鼠卵子，使卵子的染色体相互紧密结合，不易分开。当排出第一极体时，次级卵母细胞的染色体随极体一起排出达到去核目的。但此时，卵子内的MPF活性丧失，必须放入不含Etoposide和CHX的培养液中培养15h，恢复MPF活性。用秋水仙胺处理成熟的猪卵，质膜形成突起处即为凝集的染色体，将突起吸出，即能去核。此方法的囊胚率与对照相比无差别，并出生了核移植的小猪。
（4）供体核的导入将供体细胞核移入去核的卵母细胞，是克隆的重要步骤。随着核移植技术的发展，已有多种移核的方法，且不同动物所使用的移核方法也有所不同。
1）融合法融合法是指利用电脉冲或化学方法使供体细胞膜与卵母细胞质膜接触融合，以使供体核进入到受体卵母细胞胞质中。融合包括病毒融合、化学融合及电融合3类。病毒介导的融合：多种病毒可介导融合，其中较常用的是灭活的仙台病毒（HVJ）。将病毒颗粒附着在细胞膜上，使细胞戮着成堆，在37℃下，豁着部位的细胞膜被破坏，形成通道，细胞质融合在一起，完成细胞融合。化学融合：利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）可诱导细胞的融合。其原理是将待融合的细胞放入含PEG的溶液中处理，PEG可使细胞膜解聚，然后接触部位的细胞膜融合，胞质汇合，使两细胞得以融合。电融合：Willadson 等1986年在绵羊的克隆中首次引用了电融合的方法，现在已成为动物克隆中普遍采用的融合方法。其原理是在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在2个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。现已发现，不同的动物所使用的融合液的成分，融合时的电压参数会有所不同。改进融合液的成分，可提高融合率甚至胚胎发育率。在这方面，不同的动物还需要不断探索理想的融合条件。
2）胞质内注射法胞质内注射法是指直接将供体细胞核注射入去核卵母细胞中，不需经过融合。其优点是操作后得到的都是重构胚，而融合的方法一般不会达到100%的融合率。不足之处是对操作的技术要求较高或需要借助一定的设备。胞质内注射法最初是在小鼠的克隆中发展起来的。主要是借助一种称为Piezo的压电装置完成的。Piezo可以在瞬间产生高的冲力，将细胞核送入胞质内，而不致造成卵子膜的破裂。利用这种方法已得到多批克隆小鼠。2000年，Onishi等利用这一方法得到了克隆猪。
（5）重构胚的活化在正常受精过程中，精子对卵子有一个激活的作用。激活主要是降低MII期卵母细胞中成熟促进因子（maturation-promoting factor，MPF）活性，使受精卵进入细胞周期，启动胚胎发育。由于体细胞与精子不同，无激活卵母细胞的能力。因此，将供体核导入去核卵母细胞以后，要对重构卵进行激活，以启动胚胎发育。常用的激活方法有：电刺激活化法和化学激活法。
1）电刺激活化法电刺激活化法主要是通过电流刺激，使卵母细胞膜的通透性发生变化，介导了细胞内外物质的运输。其原理是在瞬间高压电场的作用下，引起细胞膜发生瞬间的变化，使细胞膜瞬间形成很多微孔，溶液中的Ca2+离子通过微孔进入细胞质，使细胞内Ca2+离子呈脉冲式升高激活卵子。多次电刺激引起的Ca2+离子的多次脉冲式升高，可以模拟在自然条件下发生的受精过程。在哺乳动物体细胞核移植中，此法被广泛地应用。
2）化学激活法化学激活法是利用化学激活剂对卵子进行激活的方法。能够用于化学激活的化学试剂有Ca2+离子、三磷酸肌醇、乙醇、氯化锶（SrCl2）、精子因子等。离子霉素-6-DMAP是目前为止牛羊核移植卵母细胞激活上应用效果最好的化学试剂。
（6）重构胚的培养与移植重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体。家兔和猪重构胚在体外培养24h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑葚胚时移植。培养的方法主要有体外培养和体内培养2种方法。体内培养是将构建的重构胚用琼脂包埋后移入绵羊或家兔输卵管内。培养一定时间后，再用培养液冲输卵管，得到发育到一定时期的胚胎，然后将胚胎移植到同期发情的受体中。但这种方法操作比较复杂，成本高，不利于商业性核移植。体外培养：体外培养是指将重构胚培养于人工配制的培养液中，在CO2箱中培养到一定时期再移植。这是目前大多数实验室采用的培养方法。在体外进行重构胚培养时，选择适当的培养液是非常重要的。重构胚的移植可根据受体动物的不同分为手术移植和非手术移植，对于2-细胞期到桑葚胚之前的胚胎多为手术输卵管移植，而桑葚胚和囊胚多数采用非手术子宫移植。
（三）转基因克隆技术
转基因克隆技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。将转基因技术与动物克隆技术有机结合形成的转基因克隆技术，在畜牧业上可使转基因动物生产效率大为提高。通过转染的方法先将目标基因导入家畜体细胞，再利用克隆技术使携带目标基因的家畜后代数目迅速扩增，所需动物数大幅度减少（比显微注射法所需动物数减少一半），使少数优秀个体迅速扩大成群，并具有生产效率高、周期短、成本低等明显优势。同时，结合胚胎性别鉴定技术可生产出所期望性别的转基因动物。英国罗斯林研究所宣布已成功克隆出3只携带有人的基因、能高水平地表达人凝血因子IX（125μg/ml）的绵羊，展示了转基因克隆动物技术的可能性。
三、动物克隆技术的应用
随着生物技术的不断发展和克隆技术的逐步完善，动物克隆技术已成为生物研究的新热点。用该技术我们有希望实现物种大量繁殖、性状改良以及珍稀动物的保护，实现生物反应器大量高效生产药用蛋白，实现动物器官异种移植治疗和挽救更多生命。
（一）物种改良和保护濒危动物
将动物克隆与传统的育种技术相结合，快速改善种群遗传结构，大量培育高产低耗优质抗逆新品种。同时利用该技术和基因工程细胞工程等生物技术，保存和挽救濒危动物，使得人类赖以生存的生态环境免遭破坏。众所周知，大熊猫是我国的一种珍贵哺乳动物。由于环境及其自身生殖能力低下等原因，其种群数量日渐减少，被有关国际组织列为世界20大濒危灭绝物种之一。我国的金丝猴、东北虎、扬子鳄现存数量也不多，均有希望通过动物克隆技术得到挽救和保护。另外，将来如能弄清细胞胚胎发育调控和死亡等基础生物学问题，利用该技术就可以大量生产实验动物模型并最大限度避免个体差异，使得医学和兽医学研究的实验结果更加准确。
（二）生物医药方面
通过转基因技术和动物克隆技术相结合，将动物个体开发成为活体发酵罐，按照工程设计要求生产预期的药物蛋白；目前利用转基因克隆动物生产药用蛋白主要有3种途径：一是通过血液，例如将人的血红蛋白基因转入猪细胞，通过转基因猪来生产人血红蛋白。二是通过尿腺在转基因小鼠的尿液中表达出人的生长激素；三是通过乳腺，泌乳是动物的基本生理功能，而且乳腺能大量泌乳，对重组蛋白质进行翻译后加工、糖基化等，所以乳腺是目前公认的生产重组蛋白较理想的动物器官。1991年，有人将人α1抗胰蛋白酶基因导入绵羊体内，得到了带有该基因的转基因绵羊。转基因绵羊能以泌乳的方式生产人α1抗胰蛋白酶，产量达每升35g，于是，转基因绵羊就变成了一个能生产药物的活工厂。1997年底，英国Roslin研究所和PPL公司通过克隆转基因体细胞，获得了6只整合neo或neo和F-Ⅸ基因绵羊，这标志着核移植介导的转基因技术成功问世。2000年，英国PPL公司将人AAT基因定点整合到胎仔成纤维细胞的α1原纤维（procollagen）基因座位，而后用转基因细胞进行核移植，生产出世界首例基因打靶绵羊，其中AAT蛋白含量达到了650mg/L，远高于显微注射法的18mg/L的水平。2004年，台湾培育出带有血友病的“第 Ⅷ 凝血因子”的体细胞克隆羊，这只克隆羊在2005年产下一只带有同样的“第 Ⅷ 凝血因子”的公羊。
（三）医学方面
人类细胞系的克隆，可产生单克隆抗体，用来诊断和研究疾病。利用无性繁殖技术，还可培育出为人类器官移植提供来源的特殊动物品种。据报道全世界每18min就会增加一个等待器官移植的新病人，但是人供体器官严重缺乏，科学家研究发现动物器官的异种移植才是最有效的解决途径。由于猪器官与人的器官在大小功能上比较接近，猪作为人类器官移植的供体动物研究较多，很早就有医生使用猪的心脏瓣膜凝结因子、胰岛细胞，甚至脑细胞治疗人类疾病。然而目前异种器官移植还存在超急性排斥反应和PERV感染2个问题。针对以上问题，科学家已经找到引起超排斥反应的基因-1，3半乳糖基转移酶基因，并通过竞争和抑制该基因表达，以及从供核细胞中剔除该基因来阻止超急性排斥反应的发生。我国在“治疗性克隆”研究领域获得重大突破，“治疗性克隆”课题被列为国家级重点基础研究项目。此课题分为上、中、下游3块，上海市转基因研究中心成国祥博士负责上游研究，上海第二医科大学盛惠珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。其整体目标是，将病人的体细胞核移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外诱导分化成特定的组织或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织或器官移植到病人身上。利用这种方法，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难的免疫排斥反应，同时还使得组织或器官有了良好的、充分的来源。目前，由上海市转基因研究中心负责的上游研究工作，即把病人的体细胞移到去核的卵母细胞，并经一系列的处理发育至囊胚取得成功。
（四）牧业方面
选育遗传性状稳定的良种家畜，不仅省时省力，还可加快繁殖速度。
1.用于优良品种的保持如荷兰奶牛年产奶5000kg，最高可达26000kg；法国夏洛莱（Charolasis）牛每头可产600～700kg优质牛肉；澳洲的美丽奴细毛羊（australian merino）年剪毛量为8kg以上，是高级毛料制品的原料。大约克猪6个月体重可达105kg。家禽中我国的丝毛乌骨鸡、北京油鸡，具有特殊风味与药用价值。育成一个新品种需要很长时期，牛为15年，羊、猪为10年，鸡为8年。就地克隆，就等于就地育种与良种繁殖。
2.培育遗传均一的实验动物（近交系）克隆技术为近交系实验动物培育提供了新途径。通过这一途径培育的实验动物，遗传组成完全一致，并且比用传统的近亲繁殖方法更省时，品系更纯。在实验研究中，克隆动物比普通近交系动物的应用更优。
（五）培育各种疾病动物模型
利用动物克隆技术可以培育基因完全一致的实验动物模型，为遗传学、病理学研究提供良好的实验材料。
第四节 基因敲除动物
基因敲除（gene knock-out），又称基因打靶（gene targeting），是通过一定的途径使目的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除是指通过外源DNA 与染色体DNA 之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA 片段的技术。
20世纪80年代初，小鼠胚胎干细胞的分离和体外培养的成功为基因敲除奠定了技术基础。1985年，哺乳动物细胞中同源重组的存在得到首次证实，这又为基因敲除奠定了理论基础。2年以后，Smithies和Capecchi等2个研究小组同时报道在小鼠胚胎干细胞中进行了基因敲除。1989年，Thompson 等通过基于胚胎干细胞囊胚注射的基因敲除，建立了次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（hrpt）被定点剔除的小鼠模型，随后又产生了许多小鼠基因敲除动物模型。
20多年以来，在胚胎干细胞技术和同源重组（homologous recombination）技术基础上发展起来的基因敲除技术得到了蓬勃的发展。而且，随着基因敲除技术的发展，新的原理和技术也被运用到基因敲除中来，比较成功的主要有基因的插入突变和iRNA。但是，利用基因的同源重组原理进行基因敲除仍然是目前建立基因敲除动物模型普遍使用的方法。
一、利用同源重组进行基因敲除
（一）基因敲除的技术程序
基于同源重组的基因敲除技术程序基本包括：构建打靶载体；将靶载体导入小鼠胚胎干细胞中，使载体上的同源DNA 片段与胚胎干细胞中的相应部位发生同源重组；筛选出发生了定点基因敲除的胚胎干细胞；将筛选出的胚胎干细胞注入小鼠的囊胚，将囊胚导入假孕母鼠子宫；将得到的嵌合体进一步杂交，获得含外源基因的纯合子，即建成基因敲除动物模型。
1.打靶载体的构建打靶载体通常都包含有两段与打靶目标位点两端同源的区域，中间一段不同源且为目的序列，并带有某种药物筛选标记（如neo 基因）。根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点的位置不同，打靶载体分为插入型载体和置换型载体2种类型。其中，以置换型载体较为常用。
=2.胚胎干细胞的获得目前基因敲除常用的胚胎干细胞是小鼠品系129，其他如兔、猪、鸡的胚胎干细胞也有使用。
3.同源重组将打靶载体导入胚胎干细胞中，使其与胚胎干细胞内的同源序列发生同源重组。常用的导入方法有电穿孔法、显微注射法等。其中显微注射法应用最广，命中率高，但是技术难度较大；电穿孔法的命中率较低，但是便于操作。
4.同源重组阳性细胞的筛选基因敲除中同源重组阳性细胞的筛选多采用正负筛选策略（positive and negative selection，PNS）。在一个置换型基因打靶载体中，正向选择基因neo插入载体的目的片段中，负选择基因HSV-tk（human semian virus-thymidine kinase）置于目的片段的外侧。neo 基因有双重作用，一方面形成靶位基因的插入突变，同时作为正向筛选的标记；HSV-tk基因是负选择基因，含有HSV-tk的重组细胞对丙氧鸟苷（Ganciclovir，GANC）敏感，在GANC 培养基中不能存活。其他还有多种筛选方法，如PCR 筛选法、poly-A 缺失筛选、启动子缺失筛选等。
5.胚胎干细胞胚胎嵌合体的产生基因敲除产生胚胎干细胞胚胎嵌合体的传统方法是通过显微操作系统将胚胎干细胞注射入处于囊胚期的胚胎中，但是这种方法需要熟练的技术和昂贵的设备。近年来，人们通过将8细胞期的胚胎和胚胎干细胞聚集在一起的方法也得到了胚胎干细胞胚胎嵌合体。这种方法无需特殊设备，只需要有基本的胚胎操作技巧即可。
6.表型研究与基因敲除纯合体动物的获得一般可通过观察得到的嵌合体动物的生物学性状的改变而达到研究基因功能的目的。但是，因为同源重组常发生在一对染色体中的一条染色体上，所以常需进行2代以上的遗传才能得到遗传稳定的基因敲除的纯合体动物。
（二）常用的基因敲除策略
1.完全基因敲除敲除中常用的策略之一是利用PNS 载体，借助正向选择标记通常插入靶基因中最重要的外显子中，或者通过同源重组删除靶基因最重要的功能域，实现完全的基因敲除（complete knock-out）。无论是插入型载体还是置换型载体，在发生同源重组时都有可能将打靶载体上正向选择标记基因和外源DNA 片段同时导入染色体。
为了解决基因打靶后外源标记基因的残留问题，20世纪90年代又发展出了2种新的打靶策略。
一种是所谓的“打了就走”（hit and run）策略，又称为进退策略，由Reid 等于1991年提出。其主要特点是一个打靶载体，发生2次重组（一次双交换，一次染色体内重组）。第一步用插入型载体进行同源重组，第二步利用药物抗性基因筛选阳性细胞。这一策略的缺点是筛选时间长，染色体内重组无法精确控制，结果可能得到无突变的原始基因；而且无法同时引进多个位点突变。
另一种是标记和置换（tag and exchange）法，由Askew 等于1993年提出，其特点是2个打靶载体，2次重组，对同一位点进行多次突变时可节省时间。第一步同源重组时正负选择标记插入，对靶基因进行标记；第2步打靶用同源序列上带有精细突变的载体来转染第一步得到的胚胎干细胞克隆，带有精细突变的同源序列将置换下被“标记”的靶基因。这一策略的缺点是二次打靶操作困难，长时间的体外操作可能会影响胚胎干细胞发育成生殖细胞的能力。这2种策略的共同特点是基因打靶之后无外源标记基因残留。
2.条件性基因敲除条件性基因敲除实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre 介导的位点特异性重组技术，将对某一基因的修饰限定于某一特定类型的细胞或者某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。
Cre-Loxp 系统由Hua Gu 和JD Marth 等人于1993年提出，这一系统包括Cre 重组酶和loxP 位点两部分。前者由来自E。coli 噬菌体P1的cre基因编码，loxP 由2个13bp 的反向重复顺序和8bp 的间隔区域构成。Cre 重组酶可介导34bp 的重复单元，切除同向重复的2个loxP 位点间的DNA 片段和一个loxP 位点，保留一个loxP 位点。除了Cre-Loxp 系统外，酵母中的FLP-frt 系统和R 重组酶系统具有与之相似的功能。
进行条件性基因敲除时，首先要构建靶基因2侧排列有同向loxP 位点的打靶载体，经与胚胎干细胞进行同源重组，筛选并得到表型与野生型一样的小鼠。这种小鼠虽然带有位于2个同向loxP 位点之间的靶基因，但靶基因并未发生其他变化。同时构建Cre 转基因小鼠。当这2种小鼠杂交时，便可得到同时带有位于2个同向loxP 位点之间的靶基因和Cre 基因的子代。结果Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应。因此，只要控制Cre 表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。
条件性基因敲除可用于研究基因在特定组织细胞或个体发育特定阶段的功能，尤其对于完全敲除具有致死效应的基因来说，条件性基因敲除对于其功能的研究具有重要意义。
3.诱导性基因敲除诱导性基因敲除是指利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在loxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的。采用这种基因敲除技术，可以人为地控制诱导基因突变的时间；可以避免因基因突变而产生死胎的问题；如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。
根据所用诱导剂的种类，诱导性基因打靶可分为四环素诱导型、干扰素诱导型和激素诱导型等几种类型。其中，前二者所用诱导剂为控制Cre 基因表达的启动子活性的活化物，而后者所用诱导剂为Cre 酶活性的激活物。
二、利用随机插入突变进行基因敲除——基因捕获
1.基因捕获（gene trapping）的原理基因捕获是一种新型的利用随机插入突变进行基因敲除的方法。其原理是利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌等载体，在目标基因组中进行随机插入，建立一个携带随机插入突变的胚胎干细胞库。常见的基因捕获载体包含一个无启动子的报道基因，例如neo 基因。如果neo 基因随机插入到胚胎干细胞的染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达，这种胚胎干细胞就可以从含G418选择培养基中筛选出来。最后，可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得捕获基因的信息。
2.基因捕获的优缺点常规的基因打靶方法，必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的基因敲除载体并筛选中靶胚胎干细胞，这需要耗费大量的人力和时间。要想获得一个基因敲除动物纯合体，通常需要1年以上时间。
采用基因捕获法，可以节约大量的工作和费用，更快速地进行基因功能的分析。但是这种方法只能敲除在胚胎干细胞中表达的基因，而且无法对基因进行精细的遗传修饰。
三、利用RNAi进行基因敲除
1.RNAi基因敲除的原理RNAi现象是由康奈尔大学的Su Guo 博士于1995年在用反义RNA阻断线虫基因表达时发现的。当双链RNA进入细胞后，在Dicer 的作用下被裂解成siRNA；同时，在RdRP（RNA-directed RNA polymerase）作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。随后，siRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物。此复合物同siRNA的互补mRNA结合，一方面使mRNA 被RNA 酶裂解；另一方面以siRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA 互补链。结果mRNA 变成了双链RNA，它在Dicer 的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA 具有诱发RNAi 作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。
2.RNAi基因敲除的特点与同源重组法相比，RNAi基因敲除更为简便，大大缩短了实验周期。对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中进行RNAi基因敲除以研究它的功能。RNAi 还能高效特异的阻断基因的表达，因此也是研究信号转导通路的良好工具。
四、基因敲除的应用
基因敲除技术在生命科学中具有重大的应用价值。
1.建立人类疾病模型目前已经建立的基因敲除鼠模型已有近千种，并以每年数百种的速度增加着，其中以各种疾病相关基因的敲除模型为主，内容涉及肿瘤、心血管疾病、糖尿病和肥胖症、血液病、生殖障碍、免疫系统疾病等诸多方面。这些疾病动物模型对于研究人类各种疾病，尤其是遗传病的发病机制、疾病的诊断、预防以及基因治疗等有着重大意义。例如，Donehower 和他的同事们首次得到了敲除P53基因的小鼠。研究结果证明，缺失正常的P53基因使鼠有产生多种肿瘤的倾向，说明P53是一种肿瘤抑制基因。
2.器官移植基因敲除技术有望解决人类器官移植的两大难题：器官来源与排斥反应。英国PPL公司采用基因敲除技术，敲除了猪的α-1，3-半乳糖苷转移酶基因，希望采用猪的器官用于异种器官移植，突破器官来源受限的难题而又不会引发免疫排斥反应。α-1，3-半乳糖苷转移酶抗原决定簇位于猪的细胞膜表面，是抑制异种器官移植的重要障碍。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生。虽然还有许多问题需要解决，但使人类看到了希望。
3.转基因动物研究基因敲除使人们定点、定量地改变哺乳动物基因组结构的梦想成为现实，而且，与传统的转基因技术相比，基因打靶技术所要求的动物数量大大减少。另外，显微注射生产的转基因动物因为存在随机整合，容易引起染色体沉默效应而抑制转基因的表达。基因敲除是在特定位点引入单拷贝突变，可以克服这种负效应。
伴随着体细胞克隆技术的发展，转基因动物的研究也将得到新的发展。例如，现已产生了一种小鼠，它的主要免疫球蛋白（Ig）基因家族已被缺失，相应地用人Ig家族的轻链、重链替代，而后用单克隆抗体技术大量生产以小鼠免疫系统生产的完全人体化抗体。
基因敲除还可用于研究基因结构与功能关系、药物依赖性研究、动物育种等方面。
在基因敲除技术的应用过程中，我们应该意识到：基因敲除不单纯是一种灭活基因的技术，还是有目的地改变基因活性的一种手段。
