第一节 实验动物的胚胎工程
实验动物学是现代生命科学的重要组成部分，随着生命科学的不断发展，现代实验动物学已经从过去只注重实验动物的饲养管理和实验操作的宏观向综合了整体水平、细胞水平和分子水平的微观方向发展。胚胎工程是指运用人工方法对动物的胚胎及配子进行操作和改造，是改良动物品种、品系，保存动物种子资源及转基因动物的重要手段。20世纪后期，胚胎工程技术得到了迅速发展，现有技术体系主要包括：胚胎移植相关技术、胚胎分割与胚胎嵌合、胚胎干细胞技术等。其中胚胎移植相关技术又包括排卵控制、体外受精和显微受精、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移植等。胚胎工程技术对于实验动物的遗传育种、种子保存，以及超纯系实验动物的培育具有重要的理论意义和实际应用价值。
一、胚胎移植相关技术
（一）胚胎移植
胚胎移植（embryo transfer）是一项难度较高的显微操作过程，是胚胎工程的重要基础。经胚胎生物技术处理的胚胎，必须实施胚胎移植才能达到目的，如转基因动物生产、孤雌生殖等。胚胎移植的技术程序包括供体的超数排卵、受体的同期发情、胚胎采集、胚胎的评定、胚胎的保存与培养、胚胎移植等步骤。1890年，英国剑桥大学的Walter Heape 首先获得兔胚胎移植的成功。他将分裂至4细胞期的安哥拉兔的早期胚胎移植到已经进行交配的比利时母兔的输卵管内，结果得到了6只小兔，其中2只具有长毛、白化等安哥拉兔的特征。随后，小鼠、大鼠及多种哺乳动物的胚胎移植均获得成功，我国也对兔进行了比较系统的胚胎移植研究。
胚胎在发育的最初阶段将于4天内由一个细胞分裂至16个细胞，随后依次发育成为桑葚胚、胚泡和囊胚。按照胚胎发育阶段不同，移植部位也不同，胚胎移植据此分为输卵管移植和子宫移植。原核胚胎到8细胞期前的胚胎进行输卵管移植，8细胞期后的胚胎进行子宫移植。输卵管移植技术难度较大，以大鼠为例，进行输卵管移植时，一般是找到输卵管伞口，将移卵管从输卵管伞口插入。子宫移植的技术难度不大，较易掌握。按照操作方法，胚胎移植又可分为手术法和非手术法。对于小型实验动物常采用手术法；非手术法常用于牛、马等大动物，一般使用类似于人工授精的专用输胚枪，直接插入排卵侧子宫角内注入胚胎。
胚胎移植对于生产SPF级实验动物、培育实验动物、保存品种资源以及加强国际交流等具有重要意义。
（二）排卵控制
排卵控制是通过对雌性动物采用外源激素处理，改变其性周期和排卵数来实现的。国内外排卵控制研究中常用到的效果较好的激素有促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）。其中FSH 生物功能是刺激卵巢中卵泡的成熟并分泌雌激素；LH 也称促间质细胞激素（ICSH），其生物功能是激发排卵，促使黄体从萎缩破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素；PMSG 可以促进雌性动物卵泡的发育、排卵及黄体的形成；hCG 也可促进卵泡发育和排卵。实际应用中，常把FSH 和LH，hCG 和PMSG 配合使用，可取得较好效果。
哺乳动物的排卵控制包括排卵时间的控制与排卵数量的控制。通过排卵时间的控制，可以得到特定胚龄的卵子，以供研究用，例如，转基因使用的原核胚。排卵数量的控制又称为超数排卵（super ovulation），其目的是为了获得更多的卵子。一般来说，6～18周龄的雌性小鼠和8周龄以上雄鼠自然交配，选择见到阴道栓（plug）的雌鼠，可获得7～13个受精卵。而经超数排卵处理之后，可以得到高于正常排卵量数倍的卵。例如，实验兔正常情况下平均每次排卵9枚，通过超排，曾有1只兔一次获得88枚胚胎；KM小鼠平均每次排卵8枚左右，经超排处理，曾有1只KM 小鼠一次获得83枚胚胎。研究发现，不同品系小鼠超排效果不同。近交系小鼠C57BL/6J、CBA、129/SVJ、CBA/H、SJL/J、C58/J的超排效果要比BALB/cJ、C3H/HeJ、A/J、129/J、DBA/2J好。前者每只小鼠可收集40～60个卵，后者只有15个左右。
在生产中，应用超数排卵-胚胎移植（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）技术，可迅速扩大目的种群的后代数量，加快遗传进展。同时，满足胚胎工程、遗传工程研究及建立胚胎库的需要。
（三）体外受精和显微受精
1.体外受精体外受精（in vitro fertilization，IVF）是成熟卵细胞与经过处理的精子在体外结合而发育成合子的过程。体外受精的合子经过体外或者异种动物体内培养，再移到同种动物体内妊娠产仔，由此得到的动物称为试管动物。
早在1878年，德国科学家Schenk 就开始进行哺乳动物卵子体外受精的尝试。他将排卵前的卵母细胞和附睾内精子放入子宫液内进行孵育，观察到第二极体释放和卵裂现象。但是直到20世纪40年代，世界上也只有为数不多的科学家能成功地进行哺乳动物体外受精实验。1951年，美籍华人张明觉（Chang M。C。）和澳大利亚的Austin 几乎同时发现只有在雌性生殖道停留一定时间的精子才能成功地与卵子结合，进行体外受精。Austin 于次年将这种现象命名为获能（capacitation）。从此以后，体外受精研究蓬勃开展起来。
自1959年Chang 利用获能处理的精子进行体外受精实验获得第一例试管动物试管兔以来，目前已经有近20种实验动物体外受精取得成功，在小鼠、大鼠、兔、恒河猴等多种动物获得了后代。1964年，Yanagimachi 和Chang 以金黄仓鼠为实验材料的研究解决了以前精子获能须通过若干繁琐而经验化的步骤的问题，开创了在简单培养液中进行获能处理的方法，大大加快了体外受精技术的发展。国内体外受精研究取得成功的例子有：小鼠（1987年，中科院遗传所）、牛和绵羊（1989年，内蒙古大学）、兔（1990年，西北农业大学）、山羊（1991年，西北农业大学）。
（1）卵母细胞的体外成熟卵母细胞的体外成熟和精子的体外获能是体外受精的基础。卵母细胞减数分裂成熟是指长足（fully grown）的卵母细胞向成熟卵子转化的过程。长足的卵母细胞在体外可不依赖于激素而自发成熟，而且体外培养条件下卵母细胞发生生发泡破裂、纺锤体形成等事件的时序与体内观察到的一致。因此，卵母细胞的体外成熟一方面可以为体外受精提供大量的可利用卵母细胞，另一方面也为卵母细胞的体内成熟提供了结构和生化研究的理想模型。卵母细胞的体外成熟主要包括减数分裂的恢复和完成，以及细胞质、细胞膜、透明带、卵丘细胞的成熟变化。以小鼠为例，在体外培养几小时后卵母细胞完成生发泡破裂，此间同时发生染色体凝集；培养6h后，出现形态明显的减数分裂纺锤体，9h后则十分清晰；体外培养10～13h后，在纺锤体区伸出一突起并最终形成第一极体。随后末期中间体（包绕末期纺锤体的中间区域的嗜碱膜囊环）形成，极体脱离开始。
卵母细胞体外成熟受到多种因素影响，如动物种类、年龄、培养条件等。小鼠、大鼠和人的卵子比较透明，可借助一般实体或相差显微镜观察卵母细胞是否发生了生发泡破裂，以此判断卵母细胞是否成熟。
（2）精子的发生与体外获能精子是在睾丸中发生、变态并进一步在附睾中成熟而获得正常受精能力的。精原细胞经数次有丝分裂后形成初级精母细胞，后者再经一次分裂形成次级精母细胞。随后次级精母细胞在完成第二次减数分裂后形成单倍体的球形精子细胞，球形精子细胞发生变态，脱离曲细精管，依次经过附睾头、附睾体和附睾尾，最终发育成为成熟精子。处于不同发育时期的生精细胞，由于其成熟度不同，所以受精潜力也有所差别。常规体外受精多采用成熟度较高的附睾尾和射出的精子。
体外受精所用的精子在大、中型动物可采用人工按摩或电刺激法获得，小型动物需用手术法从附睾获得。卵子来源有2种方法，小型动物系采用超数排卵处理，从输卵管采集体内成熟卵子；或采用手术方法，从卵巢上采集未成熟卵子进行体外成熟。牛、羊等大中型动物可进行活体采卵或从屠宰后动物的卵巢获得。
体外受精之前，精子必须在雌性生殖道或体外培养液中停留一段时间，才能具备受精能力。精子体外获能是体外受精技术中的关键环节之一，可受到多种因素的影响，如孵育温度、动物种类、采精位置、培养液组成等。目前人工获能已有很大进展，特别是家畜中牛精子的人工获能，各国研究者已发展了一系列有效方法。获能过程总体包括2个步骤，精子的洗涤和特定成分诱导精子获能和顶体反应。
精子活力是一项十分重要的指标，是精子在雌性生殖道运行并成功受精的前提。为了获得活力较强的精子，常常对精子进行一些预处理。浮游（swim up）技术是体外受精中普遍采用的步骤，该程序一般是将洗涤后的精液放入适当的浮游溶液中，在培养箱中静置30～60min，这期间运动力较高的精子浮游到浮游溶液中。实验中也有省略精子浮游步骤的。其他处理方法，如潜游（swim down）技术、玻璃棉（glasswool）过滤、BSA/Percoll 密度梯度等方法，均可获得质量较高的精子。
除了通过对精子进行预处理来分离出高活力的精子外，也可以通过添加一些化学试剂来刺激精子活力并保持之。咖啡因可通过抑制环核苷酸磷酸二酯酶而导致细胞内cAMP 的积累。1988年，Pomeroy 等发现咖啡因能通过提高小鼠精子活力而提高受精率。其实验显示咖啡因还能提高顶体反应、精子结合透明带的能力以及精子与卵膜的融合能力。腺苷和它的类似物（2-氯腺苷和2-脱氧腺苷）可刺激cAMP 产量而提高精子活力。PHE 是青霉胺（penicilliamine）、亚牛磺酸（hypotaurine）和肾上腺素（epinephrine）的混合物，有研究显示在体外受精培养液中添加PHE 可显著提高精子活力和穿卵率，但也有人认为用PHE 没有什么明显效果。其他能提高精子活力的物质还有血小板激活因子（PAF）、谷胱甘肽（GSH）、己酮可可碱（pentoxifylline）和茶酚（theophylline）等。
（3）体外受精中的重要因素温度和气相是体外受精中的重要因素，很小的温差就可能对体外受精造成很大影响，配子和胚胎必须置于严密控制的气相中（例如含5%CO2的空气，或5%CO2+5%O2+90%N2），并且用100%湿度避免培养液的蒸发。同时还应注意，培养箱以外的操作，如精子浮游、洗涤和卵子上卵丘细胞的去除等，应尽可能快地进行。另外，受精液应能提供精子穿卵的正常条件。1977年，Bavister 和Yanagimachi 在仓鼠体外受精研究中配制出TALP 液，该液包括m-Tyrode’s 液、0.6%BSA、乳酸钠和丙酮酸钠。后有人将TALP 液引入到牛的体外受精中，取得了良好的效果。
目前制约体外受精技术发展的因素还有很多。在体外培养的卵母细胞的细胞质是否真正成熟不仅影响到受精，而且对卵裂及胚胎发育甚至着床和出生后也有较大影响，应在培养条件上进行更多研究。多精子受精可导致正常发育率低，通过调整精子浓度或受精时间对其进行控制的技术还需进一步完善。体外受精的胚胎在体外发育至一定阶段时会发生退行性变化，即发育阻滞（block），不同动物发生发育阻滞的阶段亦不同。人胚胎发生在晚4至早8细胞期，小鼠发生在2细胞期，牛和绵羊发生在8到16细胞期。胚胎发育阻滞可能是由于培养条件的不完善引起的，运用共培养或在培养液中添加特殊成分可使一部分胚胎通过发育阻滞阶段继续发育。
2.显微受精显微受精（microfertilization）技术是20世纪80年代后期发展起来的通过对动物配子进行显微操作以使其受精的技术。它是在体外受精的基础上，随着显微操作技术和设备的不断发展和完善而出现的。
最早报道显微受精的是Hiromoto，1962年，他发现向爪蟾的卵母细胞中注射同种或异种精子均可形成雌雄原核，并且注射过程能激活卵母细胞。除此之外，最早进行显微受精研究的还有Uehara 和Yanagimachi，他们发现将仓鼠的精子显微注射到仓鼠的卵母细胞内可以形成雄原核，并可以完成早期胚胎发育。此后，Thadani、Perreault、Zirkin等对大鼠、小鼠精蛋白的生化性质、DNA 合成对显微受精的影响等做了大量的基础研究，对显微受精技术的完善和发展起到了重要作用。1988年，Iritani 和Mann 分别报道了兔单精子胞质内受精和小鼠单精子带下受精获得后代。后有研究者用不活动的兔精子注射到卵母细胞质内也获得了后代。1993年，我国获得了首例显微受精仔兔，随后在用小鼠附睾精子、球形精、次级精母细胞乃至初级精母细胞进行卵细胞质内注射均获得了正常发育的小鼠后代。
（1）显微受精技术的基本操作方法显微受精技术目前有透明带钻孔（ZPD）、透明带带下注射（SUZI）和卵细胞质内注射（ICSI）等方法。为方便精子进入卵母细胞，在透明带上钻开或打开一个小孔即透明带打孔技术。这种技术目前已经基本被淘汰，只是有时作为辅助手段，在生精细胞显微受精中还会用到。透明带带下注射法是将一个或多个精子注入卵周隙，这是在透明带钻孔技术的基础上，为了控制多精受精而采用的方法。事实证明，精子带下注射数量是此项技术成功的关键。胞质内注射法是将精子直接注入卵母细胞质以完成受精过程的方法。这种方法对卵母细胞的损伤大于透明带带下注射法，同时其正常受精率显著高于透明带带下注射法，但这种方法往往比透明带带下注射法产生更多的三倍体胚胎。可见2种方法各有优缺点，一般活动精子多选择透明带带下注射法，而死的或不完整的精子则选择胞质内注射法。这是因为卵细胞质内注射可解除精子穿入透明带和精卵质膜融合的双重屏障作用。因此，进行卵细胞质内注射时对精子的活动能力不做要求。研究显示，即使是死的、不完整的精子注射之后也能产生后代。
（2）影响显微受精的因素在实际操作过程中，显微受精可受到多种因素的影响，主要有注射部位、精子状态、精子发生阶段、卵母细胞状态、显微操作环境条件等。
注射部位或注射方式的选择是由实验动物卵母细胞的耐操作能力确定的。大量实验表明，鼠类尤其是小鼠卵母细胞进行胞质内注射十分困难，所以多采用带下注射法，受精率可达到67.3%，其中54%的受精卵可发育成个体。在人类，这2种技术都十分有效。在显微受精操作中，应根据精子类型和动物种类来选择合适的注射部位，以达到满意效果。
精子的状态，如精子是否获能、顶体反应与否以及精子的新鲜程度、完整程度等都将直接影响显微受精的结果。有研究者曾用获能时间不同、顶体完整和顶体反应的精子进行透明带带下注射，结果显示获能0.5h、2h和6h精子的受精率没有显著差异，而顶体完整和顶体反应后的精子未能使卵母细胞受精。与未获能精子相比，获能精子具有更强的原核形成和发育能力。在进行透明带带下注射时，常采用获能精子。进行胞质内注射时，精子是否获能和顶体反应与否并不重要。另外，精子的死活对于胞质内注射也不是十分重要，精子核对于低温和高温都有很强的耐受性。
超数排卵的方法也是影响显微受精结果的因素之一，因为它将直接影响卵母细胞的成熟度，而高质量的卵母细胞正是显微受精成功的前提。另外，显微注射操作人员的操作技能、操作工具的质量以及操作时的环境条件都会影响显微受精的结果。
（四）胚胎培养（embryo culture）
早期胚胎的培养是胚胎工程中的重要技术环节。目前体内培养系统主要有兔输卵管、羊输卵管、离体小鼠输卵管培养系统（IMOS）、鸡胚培养系统等。体内培养系统的研究和发展使人们了解了更多的有利于胚胎发育的因子，而且为获得高质量的胚胎提供了方便而高效的工具。体外胚胎培养是指在人工创造的类似于体内条件的环境中，对获取的早期胚胎进行体外培养，以便观察其发育或人工干预某一发育过程的技术。早在20世纪80年代中期，人们就对小鼠胚胎体外培养的理论与培养方法都进行了广泛而深入地研究。
1.体外胚胎培养的方法目前体外胚胎培养一般有2种方法。一种是共培养系统，这种系统首先要求在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。另一种是简单化学限定培养法。相对而言，简单化学限定培养法使用方便、培养液配制简单，而且成分明确便于研究特定物质对胚胎发育的影响，因此在早期胚胎体外培养中得到广泛使用。
2.影响胚胎培养的因素胚胎培养过程中，有多种因素可能会影响到动物胚胎的正常发育，例如，动物品种、培养液成分、培养环境条件、培养方法等。
1989年，有研究者采用相同培养液培养不同品系小鼠1细胞期胚胎时发现，不同品系小鼠胚胎在同一培养液中囊胚发育率差异很大。这是因为不同品系小鼠的早期胚胎代谢类型并不完全相同，相应决定了对培养液的成分和浓度的要求也是不同的，因此对不同品系小鼠胚胎应采用与之发育相适应的高效、简单培养液。
培养液的成分主要有葡萄糖、氨基酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、盐类等。在进行小鼠胚胎体外培养的研究中，研究者发现培养液中的葡萄糖在8细胞期以前是引起胚胎发育阻滞的主要原因之一，在8细胞期以后又是胚胎发育的主要能源物质。所以在对小鼠胚胎体外培养时，应根据小鼠胚胎不同发育阶段代谢特点合理增减葡萄糖以获得较好的胚胎体外发育效果。氨基酸是体外培养胚胎发育的不可缺少的重要营养物质，主要作为蛋白质合成必备物质，同时还作为能量物质、一些重要物质合成前体以及有效的渗透保护剂等，在胚胎体外培养中发挥着重要作用。许多研究表明，必需氨基酸和非必需氨基酸都对附植前胚胎体外发育有促进作用。非必需氨基酸主要作用在胚胎分裂期，必需氨基酸作用时期相对较长，尤其是8细胞以后阶段。EDTA在培养液中的作用主要是螯合一些有害于胚胎发育的重金属离子。同时，EDTA和谷氨酰胺能够协同作用，替代葡萄糖成分，促进体外培养胚胎的发育。但这种协同作用的机制还需要进一步的深入研究。盐类也是培养液的基础物质，具有维持培养液正常渗透压、pH值的作用。大多数胚胎培养液采用NaHCO3/CO2缓冲系统以维持生理性的pH值（7.2～7.4）。使用这种缓冲系统时要注意，当培养液放置在空气中时，pH值将升高，导致胚胎损伤甚至死亡。可作为替代的另一种缓冲体系为磷酸盐缓冲体系。体外操作时一般使用HEPES缓冲体系。
在胚胎体外培养过程中，温度、气相环境、渗透压、培养液中过氧化氢浓度以及培养液体积与培养胚胎数之间的比例等都是影响胚胎体外发育的重要因素。
培养方法也是影响胚胎体外发育的因素之一，胚胎培养研究早期常用试管法，后来的微滴覆盖法（Brinster法）具有更多优势，如减少培养液体积、便于定期换液等。
胚胎培养是胚胎移植技术体系中的一项重要内容，一般可应用于以下几种情况：未成熟卵子可经体外培养成熟，以进行体外受精；受精卵经培养成为卵裂球以后，用于胚胎移植或者冷冻保存；冷冻胚胎解冻后，经过培养再进行胚胎移植，可提高移植成活率；导入外源基因的受精卵培养到卵裂球后再实施胚胎移植，也可以提高成功率。另外，通过胚胎培养的实验研究，有助于逐步揭示胚胎细胞的新陈代谢、发育生长等生命活动的奥秘。
（五）胚胎保存（embryo preservation）
胚胎的保存可根据实际情况分为短期临时保存和长期冷冻保存。短期临时保存是指将暂时不使用的胚胎在37℃培养液中保存，或者在活体动物的输卵管内保存1～2天。长期冷冻保存胚胎是指应用超低温冷冻技术将胚胎保存起来而不丧失活力。1971年，Whittingham首次报道冷冻小鼠胚胎获得成功。随后，对大鼠、兔胚胎的冷冻保存也取得了成功。到目前为止，已有十多种哺乳动物胚胎冷冻获得成功。
1974年，在国际专题讨论会上首次提出了运用冷冻胚胎技术保存小鼠遗传资源的主张。1980年，国际实验动物科学委员会举行了实验动物冷冻储存专题讨论会。据统计，国际上已有20余个国家，数十个单位开展了小鼠冷冻胚胎库的工作。其中，最著名的是美国杰克逊实验室、英国医学研究中心（MRC）、美国国立卫生研究院（NIH）。我国在这方面也取得了一定发展，现已建立了国家啮齿类实验动物种子中心及啮齿类实验动物冷冻胚胎库。
目前已研究出多种冷冻保存实验动物胚胎的方法，主要有使用冷冻仪的常规冷冻法和快速玻璃化冷冻法等。其主要技术环节包括抗冻保护剂的选择与添加、植冰和降温、胚胎解冻、抗冻保护剂的去除等步骤。
1.常规冷冻法一般使用冷冻仪按照编制的程序降温。首先将经冷冻保护剂处理的胚胎以较慢速度（1℃/min）降温至-7℃，平衡10min后，在此温度诱发结晶，再平衡10min，以0.1～0.3℃/min的速度降温至-36℃以下，投入液氮中保存。按这种方法冻存的胚胎解冻时需要慢速升温（4～25℃/min）。脱去冷冻保护剂的浓度方向与冷冻时相反，按相同浓度梯度，从高浓度向低浓度进行。常用的冷冻保护剂一般为二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氨基酸、丙三醇、1，2-丙二醇（PROH）等。
常规冷冻法的优点是细胞脱水完全，细胞内不易形成冰晶；缺点是很费时，冷冻保护剂处理胚胎的时间过长，同时设备昂贵。
2.玻璃化冷冻法玻璃化冷冻法（vitrification）是Rall 和Fahy于1985年建立的一种快速，简捷有效的超低温冷冻方法。这种方法采用的高浓度冷冻保护剂组成的玻璃化液（渗透和非渗透性保护剂相结合），在低温下变黏稠，不发生结晶即可固化，此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布，是一种超快速冷冻模式。玻璃化冷冻保护液中的一般组成为：20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇和6%乙二醇。将胚胎在这种玻璃化液中处理以后，可直接投入液氮中保存。玻璃化冷冻保存的胚胎，解冻时需要快速复温。
玻璃化冷冻法简化了冷冻过程，冻存效果好，而且这种方法不需要冷冻仪器，设备简单，费用少。
超低温长期保存胚胎对生命科学的发展具有重要实际意义。该技术可应用于胚胎库的建立；优秀品种、品系动物的种质保存；为胚胎工程技术提供可用胚胎；保存基因库，免受遗传污染及遗传漂变的危害；实验动物的生物净化和育种等多个方面。而且，胚胎保存还有利于方便及时地进行地区和国际交流。
多年来，人们通过不断探索，使玻璃化冷冻技术在近20年得到了蓬勃发展，已在多种实验动物上试验成功。但是关于冷冻对细胞核的影响和胚胎冷冻的基础性研究还比较欠缺。例如，冷冻过程对于细胞形态和代谢的影响还需进一步深入研究，这对于制定可行的冷冻保存方案特别重要。
二、胚胎分割与胚胎嵌合
（一）胚胎分割（embryo bisection）
胚胎分割是通过对胚胎的显微操作，将一个胚胎的细胞分成2组或多组，经修复、发育后再移入受体，最终得到同卵双胞胎或多胞胎的过程。胚胎分割是扩大胚胎利用率的一种有效途径，已经先后在小鼠、兔、绵羊、山羊等多种动物上试验成功。
1901年，Spemann将蛙第一次卵裂后的2个卵裂球分离开，首次人工地产生了双胞胎。1970年，Mullen等将小鼠2细胞期胚胎的2个卵裂球分离开，经培养后再移植给受体，产生了哺乳动物的第一例人工双胞胎。1978年，Moustafa等又成功地将小鼠桑葚胚一分为二，得到双胞胎。目前用胚胎分割法已克隆出小鼠、家兔、山羊、绵羊、猪、牛、马等。
根据胚胎发育阶段不同，胚胎分割的操作有2种方式，一种是在8细胞阶段以前，将每个卵裂球（2～4细胞阶段）或2个卵裂球（4或8细胞阶段）作为一组，分别放入一个空的透明带内，继续发育成一个胚胎；另一种方式是对桑葚胚至囊胚期的胚胎进行分割，然后把每一份放入一个空的透明带内。后一种操作方式现已发展出多种切割方法，如显微玻璃针去带分割法、显微手术刀直接分割法、酶消化透明带显微玻璃针分割法、酶-机械去带分割法和徒手刀片分割法等。
1.显微玻璃针去带分割法在显微操作仪下固定胚胎，用显微玻璃针摘除透明带，然后对裸露胚胎进行切割。
2.显微手术刀直接分割法同样在显微操作仪下固定胚胎，直接用显微手术刀切割胚胎。
3.酶消化透明带显微玻璃针分割法先用含0.5%链霉素蛋白酶的Hanks 溶液孵育胚胎，待酶将透明带消化后，再用显微手术刀切割胚胎。
4.酶-机械去带分割法先用酶软化透明带，然后用玻璃管去除外层透明带，最后用显微手术刀将胚胎分割成2分胚胎、4分胚胎等。
5.徒手刀片分割法先用0.25%链霉素蛋白酶软化胚胎1min左右，再用2%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和PBS 溶液洗涤2次，然后使用专用手术刀徒手分割胚胎。
严格来说，胚胎分割法克隆并不是真正意义上的克隆。但是胚胎分割可使胚胎数量成倍地增长，这一点对繁殖率低、世代间隔较长的单胎动物尤为重要；胚胎分割还可得到同卵双生动物作为理想的实验研究材料，并且可用于动物性别鉴定和性别控制，可极大提高胚胎移植的实际效果。
（二）胚胎嵌合
胚胎嵌合是指将2枚或者2枚以上胚胎（同种或者异种动物胚胎）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，并移植入受体使其继续发育，最终获得具有2种动物细胞的嵌合体后代。
1961年，Tarkowski将白色的SJL近交系小鼠与黑色的C57BL/10近交系小鼠的8细胞期胚胎在体外进行融合，然后移入假孕小鼠子宫内，首次培育出黑白斑杂合的人工嵌合体小鼠后。1965年，Mintz将其方法进行改造，第一次得到了活至成年的正常嵌合体小鼠。1970年以来，相继获得了小鼠、大鼠、兔的嵌合体。1984年，英国科学家成功培育出山羊和绵羊胚胎嵌合体动物——绵山羊。我国科学家中山大学的陈系古教授也于2000年培育成功了黑白相间的嵌合体小鼠。目前得到的种间嵌合体动物有小鼠-大鼠嵌合体、绵羊-山羊嵌合体、马-斑马嵌合体、牛-水牛嵌合体。
胚胎嵌合的方法有2种。一种是聚合法，目前已广泛应用于实验动物。一般是把8细胞至桑葚胚前期的胚胎去掉透明带后，将2个胚胎的卵裂球聚合在一起，形成一个胚胎，经体外培养发育至囊胚阶段，再移植给受体。另一种是注射法，即把细胞注入到囊胚腔内。注射用细胞可以是卵裂球，也可以是发育后期胚胎细胞，甚至可以是畸胎瘤细胞和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES 细胞）。
嵌合体实验动物可以作为发育生物学的研究材料，也可以用来建立遗传疾病动物模型。另外，胚胎嵌合对于实验动物育种与濒危动物的挽救也有实际意义。
三、胚胎干细胞技术
干细胞是一类具有自我更新（self-renewing）和分化潜能的细胞，其发育受多种内在机制和微环境因素的影响。根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞（embryonic stem cell）和成体干细胞（adult stem cell）。
胚胎干细胞是一种存在于早期胚胎的具有发育全能性的细胞，它可以自我更新并分化为体内所有类型的组织细胞，包括生殖细胞。胚胎干细胞的分化和增殖是动物发育的基础。早在20世纪60年代，人们就发现小鼠畸胎瘤中存在着未分化的多能性干细胞，在适当的条件下它可形成多种细胞类型。因为畸胎瘤是原始生殖细胞癌变而形成的，因此把这种多能性干细胞称为胚胎癌细胞（embryonal carcinoma cells，EC）。但是EC细胞常常表现出某些恶性肿瘤的特征，它的染色体核型异常，分化潜能也有限，而且不能参与嵌合体动物生殖细胞的形成，并经常在嵌合体中形成肿瘤或导致胚胎早期死亡，因而人们开始寻找别的适合分离多能性干细胞的材料。研究人员尝试着从原始生殖细胞中直接分离未分化的多能性干细胞，研究结果表明，原始生殖细胞中确实含有多能性干细胞。这些细胞在体外适宜的环境中可以较长期增殖，并维持未分化状态，在不同信号刺激下可以分化为多种细胞类型，这种多能性干细胞被称为胚胎生殖细胞（embryonic germ cells，EG）。1981年，Evans和Martin等首次成功地从延迟着床的小鼠胚胎中建立了多能性干细胞系，这些细胞具有正常的二倍体核型，并可分化为多种细胞类型，被称为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）。
（一）胚胎干细胞的生物学特性
胚胎干细胞结构与早期胚胎细胞相似，胞体体积小，核大，胞浆少，有1～2个核仁。胚胎干细胞呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞间界限不清。胚胎干细胞的核型是正常的，它保留了整倍体的性质。但不同物种的胚胎干细胞的结构特征又有所不同。如小鼠胚胎干细胞形成的细胞集落一般呈紧密的球形，不易被常规消化方法分散成单细胞；而人及某些灵长类动物的胚胎干细胞形成的细胞集落相对比较扁平、松散，很容易被胰蛋白酶消化成单细胞。
胚胎干细胞在体外需要在滋养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离滋养层，就自发地进行分化。由于胚胎干细胞具有分化为各种类型组织细胞的潜能和具备正常的二倍体核型，所以与正常桑葚胚聚集或注射到囊胚腔时，它能够参与胚胎发育形成嵌合体，参与嵌合体多种组织、器官的发育。
胚胎干细胞具有培养细胞的所有特征，如可在体外培养、增殖、操作和冻存，冻存后的细胞可以在需要的时候复苏，继续培养而不失其原有的特征。
（二）胚胎干细胞的分离、培养
1.胚胎干细胞的分离目前常用的稳定的胚胎干细胞系是小鼠品系129.小鼠胚胎干细胞一般取自2.5天的桑葚胚（morula）或3.5天的早期胚泡（blastocyst），而人类的胚胎干细胞则多取自7天的胚泡。桑葚胚细胞的分离相对容易，而囊胚阶段的细胞已经开始了最初的分化，分离要复杂一些。在囊胚腔的一端是内细胞团，外侧是扁平的滋养层细胞。体外分离胚胎干细胞时，要将滋养层细胞剥离去除，取内细胞团细胞进行培养，常用的方法是免疫外科法。免疫外科法的原理是先将胚泡与兔抗小鼠的血清共同孵育一段时间后，加入补体，使外层的滋养层细胞发生溶解，而内细胞团细胞则不受影响。动物的物种、品系、受孕状态等很多因素，都会影响胚胎干细胞的分离。
此外，胚胎干细胞还可以通过克隆技术获得，即所谓的“治疗性克隆”。将小鼠的体细胞核转移到未受精的去核卵母细胞中，经锶激活使其发生卵裂形成胚泡，然后从中分离筛选胚胎干细胞。
2.胚胎干细胞的培养早在1970年，Martin 和Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。1998年，Wisconsin大学的James Thomson和Johns Hopkins大学的John Gearhart从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞。他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及3种胚层组织的能力。
在胚胎干细胞研究过程中，相继发现了几种分化抑制因子，如LIF（白血病细胞抑制因子）、DIA（分化抑制因子）、HILDA（人白细胞介素），并证明了它们在体外同样具有抑制胚胎干细胞分化的作用。胚胎干细胞常规培养液主要由LIF、胎牛血清、L-谷氨酸、非必需氨基酸、丙酮酸盐、乙醇、谷氨酰胺以及高浓度的含各种氨基酸和葡萄糖的一种培养基（DMEM）组成。其中，值得注意的是胎牛血清的浓度及其质量是影响胚胎干细胞生长状况的重要因素。
依据细胞分化抑制因子的来源不同，胚胎干细胞的培养体系分为两大类。一类为有滋养层培养体系，滋养层细胞通过接触机制和非接触机制促进胚胎干细胞增殖并阻止其分化。目前采用的滋养层有3种：STO（一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞）、MEF（小鼠原代胚胎成纤维细胞）、HEF（同源胚胎成纤维细胞）。另一类为无滋养层培养体系，需要直接在培养液中加入外源性的细胞分化抑制因子LIF。这种方法可以避开利用滋养层细胞培养胚胎干细胞的繁琐操作，排除实验中的细胞接触抑制作用及滋养细胞分泌其他因子的干扰，并避免了处理滋养层细胞时所用丝裂霉素对胚胎干细胞的毒性作用。因此，采用无滋养层培养体系是胚胎干细胞体外培养的趋势。
胚胎干细胞的体外培养应在严格的无菌条件下进行，所用的器皿和试剂都必须保证无菌而且要彻底清除去垢剂。
（三）胚胎干细胞的体外分化
胚胎干细胞的体外定向分化是胚胎干细胞研究的重要内容。从理论上讲，胚胎干细胞可分化为体内任何类型的细胞。所谓定向分化，是指在适宜条件下，胚胎干细胞能够分化为某一特定类型的细胞。研究发现，在培养体系中撤去成纤维细胞滋养层，胚胎干细胞经数天的培养，便分化形成胚体（embryo bodies），胚体中有来自外胚层的神经细胞、上皮细胞，来自中胚层的造血细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞和来自内胚层的胰岛细胞。同样，如果培养体系中不添加LIF，胚胎干细胞也会发生分化。目前已经报道，小鼠胚胎干细胞在体外可定向分化为神经元、神经胶质细胞、星型胶质细胞、胰岛细胞、脂肪细胞、心肌细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、角质形成细胞及各类血细胞等。
目前研究胚胎干细胞定向分化的常用策略有3种。第一种策略是改变细胞的培养条件，这是研究胚胎干细胞定向分化的基本策略，常用的方法有3种，一是与辅助细胞共培养。当胚胎干细胞与其他细胞一起进行培养时，随着细胞种类的不同，它将向不同方向分化。例如，PA6是一种骨髓细胞起源的基质细胞系，当小鼠胚胎干细胞与PA6细胞一起培养时，胚胎干细胞将向神经系统分化。二是在半固体培养基中原位生长分化。例如，将小鼠胚胎干细胞接种在胶原表面，将有利于它分化成内皮细胞。三是向培养基中添加生长因子及化学诱导剂等。目前常用于胚胎干细胞定向分化的生长因子有表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，常用的化学诱导剂主要是维甲酸（retinoic acid）、二甲基亚砜（DMSO）。例如，在维甲酸和双酪基环磷酸腺苷的共同作用下，胚胎干细胞可分化为血管平滑肌细胞；将小鼠胚胎干细胞置于仅含bFGF的培养基中增殖，然后加入PDGF，得到表达神经胶质前体标志分子的多能祖细胞，当除去bFGF和PDGF后，这些细胞最终向少突神经胶质细胞或星型胶质细胞分化。
第二种策略是将外源性基因导入胚胎干细胞，使其分化为某一特定类型的细胞。若把在特定发育阶段中起决定作用的基因导入胚胎干细胞的基因组中，将会使胚胎干细胞准确分化为某一特定类型的细胞。目前已有报道使用这种方法可使胚胎干细胞定向分化为神经细胞、肌肉细胞、胰腺细胞等。
第三种策略是体内定向分化。将胚胎干细胞移植到动物体的不同部位，不同微环境将使胚胎干细胞多数分化为该组织特异性的细胞。如Deacon等将小鼠胚胎干细胞直接移植到帕金森病模型大鼠的纹状体中，这些细胞多数分化为TH+的多巴胺能神经元及5-TH+的5-羟色胺能神经元，这些神经元的轴突可以延伸到宿主的纹状体内，为受损神经元提供有功能的神经支配。
（四）胚胎干细胞的应用
胚胎干细胞的高度自我更新能力和发育的全能性使其成为很多生物医学基础领域的重要研究工具。
胚胎干细胞将是我们了解胚胎发育机制的重要研究手段，可用于研究人类发育生物学，建立新的人类疾病动物模型和细胞培养模型。通过胚胎干细胞基因打靶途径建立转基因动物模型是目前最常用的转基因动物制备方法，该方法将重组子的筛选工作从传统的动物个体筛选提前到了胚胎干细胞水平，简化了实验步骤，加快了实验过程。研究人员可以应用基于胚胎干细胞与基因打靶技术的复杂转基因体系将一些在发育过程中非必需的特定基因敲除，在体内进行功能缺失研究，或是使特定基因在体内发育瞬间表达，来研究基因在胚胎不同发育时期中的作用。因此，胚胎干细胞也是进行基因功能研究的一个有效手段。另外，像阿尔茨海默病等一些神经退行性疾病的动物模型只能代表该类疾病在人类身上的部分过程，因此通过胚胎干细胞来建立体外模型具有非常重要的意义。
胚胎干细胞最激动人心的潜在应用是用来修复甚至替换丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化为所有类型组织细胞的能力，可为细胞替代治疗提供用之不竭的来源。“治疗性克隆”研究已获得多数科学家和政府的支持。任何涉及丧失正常细胞的疾病都有望通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来进行治疗，而且可以避免移植过程中引起的免疫排斥问题，还能弥补当今器官移植所面临的供体匮乏的不足。胚胎干细胞还可应用于基因治疗，矫正缺陷基因。
胚胎干细胞还可以用来生产克隆动物。通过细胞核移植技术将胚胎干细胞核移植到去核卵母细胞中，再在假孕受体子宫发育成动物个体，与重组DNA技术结合，可以快速改良和培育实验动物品种。
另外，胚胎干细胞体外培养定向诱导分化体系的建立对发育生物学中细胞分化的研究具有重要意义。
同时，肿瘤细胞的生长繁殖与干细胞之间有许多惊人的相似之处，基于此的干细胞学说，为探索肿瘤的发生机制和肿瘤的预防治疗提出了新的思路和方向。
但是，胚胎干细胞技术还不够成熟，只在小鼠获得了稳定的胚胎干细胞系。同时还有许多问题，如胚胎干细胞向不同组织细胞“定向分化”的条件、胚胎干细胞如何才能在体外发育成完整的器官等，都还有待进一步研究以寻求技术与理论上的突破。
（五）成体干细胞
在成年动物体内，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或者器官的修复、再生，这一过程就是成体干细胞进一步分化的结果。与胚胎干细胞相比，源于成体组织的成体干细胞由于完全是自身遗传背景，避免了伦理问题和免疫屏障，同时来源丰富、容易获得、体外诱导条件相对成熟，在血液病、心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病的治疗和组织损伤修复方面有广阔的应用前景，已成为生命科学研究的一个新热点。
1.成体干细胞与胚胎干细胞的异同成体干细胞与胚胎干细胞一样，都可在体外进行自我更新，并且在适宜的条件下，均可分化成为具有特殊形态和特定功能的子代细胞，但是二者之间又有着许多不同之处。
成体干细胞和胚胎干细胞的来源不同。目前胚胎干细胞多取自胚胎或流产胎仔，在伦理道德方面存在着相当大的争议；成体干细胞多来自成体的各种组织，不存在伦理道德上的压力。
成体干细胞的分离纯化相对较胚胎干细胞困难得多。这是因为胚胎干细胞的起源非常清楚，多来自囊胚的内细胞团或胎仔的生殖嵴，因此胚胎干细胞的分离纯化比较容易；而成体干细胞在成体组织中数量很少，而且人们还没有找到其特有的细胞表面标志，要对其进行分离纯化比较困难。
成体干细胞与胚胎干细胞的另一个不同之处在于分化潜能和体外增殖能力。胚胎干细胞可在体外无限增殖，而成体干细胞的增殖能力则较有限。此外，胚胎干细胞可分化为体内任何一种细胞，而成体干细胞的分化潜能相对有限。
2.成体干细胞的来源成体干细胞主要有以下几个来源。
（1）胚胎细胞由胚胎干细胞定向分化，或移植分化而成。
（2）胚胎组织由分离胚胎的组织、细胞分离或培养而成。
（3）成体组织由脐血、骨髓、外周血、骨髓间质、脂肪细胞等得到。
造血干细胞是最早发现、研究最多和最先用于治疗疾病的成体干细胞。近年来，随着干细胞研究的不断深入，几乎在所有组织中都发现了干细胞，如骨髓、脑、血管、骨骼肌、肝、胰、皮肤、胃肠道的上皮、脂肪等。
3.成体干细胞的横向分化成体干细胞已经有相当程度的分化，如果不受外加条件的影响，一种组织的成体干细胞倾向于分化成该组织的各种细胞，比如造血干细胞在体内自动分化成各种血细胞。1999年12月美国科学家Margarel Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现小鼠肌肉组织干细胞可以“横向分化”（trans-differentiation）成血液细胞。世界各地的科学家随后证实，在特定的外加条件下，一种组织的成体干细胞可以“横向分化”成其他组织的功能细胞。例如，造血干细胞可以分化成神经细胞和肝细胞；间充质干细胞可以分化成神经、肌肉、软骨和骨等多种细胞。
成体干细胞“横向分化”能力的发现是干细胞研究中的一个里程碑，为成体干细胞的应用开辟了更为广阔的前景。但是成体干细胞“横向分化”的机制还在研究之中，不能盲目得出具有“横向分化”能力的成体干细胞可取代或超过胚胎干细胞应用价值的结论，应对其进行更严格的实验检验。
