中山舰事件发生后，周恩来立即带了四名卫士去造币厂见蒋介石，路上巡逻的士兵见是周主任，都没有阻拦他。到了造币厂门口，只见门口排列着许多士兵，个个端着刺刀，如临大敌。以往周恩来去见蒋根本不需要通报，今天却不同了。他刚走到门口，一个军官走过来，“啪”地敬了个礼说：“校长有令，任何人不得擅入。请周主任稍候，我进去通报一声。”
周恩来在门口等了好一会，不见那个军官出来。再看看那些士兵，个个脸色铁青。周恩来一阵心寒，一种不祥的预感掠过心头。但被捕的那些共产党员的安危扯着他的心，即使是赴汤蹈火，他也得闯闯这阎罗殿。
正在周恩来等得不耐烦的当口，那个军官出来了，把手一摊说：“周主任，请！”周恩来随即带了四名卫士跟着军官走进去。刚走几步，忽然哗啦一声，一下子拥出十几个全副武装的士兵，把枪口对准周恩来和卫士，大声喝道：“不许动！”随即缴去了卫士的枪。周恩来怒斥他们：“我以东征军政治部主任的名义命令你们，快把枪还给我的卫士。”那个带他们进来的军官陪着笑说：“周主任不要误会，这也是校长的意思。”周恩来正要发脾气，蒋介石的警卫连长金佛庄从里院走出来说：“周主任，请你不要生气，这是不得已的事。校长正在办公室等你呢，请走吧。”周恩来知道士兵们是奉令办事，和他们再讲也没有用，见了蒋介石再说，便急步向蒋介石的办公室走去。
蒋介石正在屋里等他。一看他进来，连忙招呼：“周主任，请坐。”又吩咐卫士泡茶。周恩来摇摇手说：“不要泡了。请问蒋校长，你为什么要逮捕李之龙和共产党员？”蒋介石把手往下按按说：“周主任，不要这么大火气嘛，你听我解释。”蒋介石故作亲热地朝前凑凑说：“今天的事和共产党没有一点关系，这都是娘希匹汪精卫搞的名堂。我先把李之龙他们集中起来，是为了避免他们上汪精卫的当，这也是为贵党好啊！你今天来了，也别出去了，就在我这里住上一天，看汪精卫还能造你的什么谣。”周恩来抗议说：“你是要软禁我？”蒋介石“这个”“这个”地哼了几句说：“不要说那么严重嘛。棉湖一战，你帮了我，我是信得过你的。现在外面乱得很，我有责任保护你。”说完叫来卫士，吩咐说：“你们送周主任休息。要好生伺候，不许怠慢。”
就这样，周恩来被送到造币厂的一个豪华客房软禁起来。直到晚上，蒋介石才跑过来看他。一进屋就说：“周主任，好了，事情搞清楚了。贵党总书记陈独秀给我发来电报，说这件事完全是一场误会，国共两党还要精诚合作。”周恩来说：“什么误会？这完全是你借右派来打击共产党。我对此表示抗议。”蒋介石说：“不要这样嘛，这是误会，咱们一起吃饭去吧。”周恩来问他：“你既然连连说是误会，那些关在造币厂的共产党员什么时候放？”蒋介石说：“就放，就放。不过事情既然到了这个地步，我希望共产党员从第一军和黄埔军校退出去，以免再发生误会。”周恩来反驳说：“黄埔军校和第一军都是国共合作的武装。你要共产党员退出去，是不是要和共产党分裂？”蒋介石一听慌了，忙解释说：“不要误会，不要误会。我是非常尊重贵党的。我不止一次在军校讲演说过，谁反对共产党那就是反对我，是反对革命。我怎么会和贵党分裂呢？我只是担心若这样下去，军心不稳，指挥不统一。你还记得吧，第二次东征途中，胡宗南和陈赓为了一点小事吵起来，结果两党军人在餐厅里用餐具打斗。这样下去怎么得了？”周恩来说：“我没有忘记，第二次东征途中，当改编的第三师兵败如山倒的时候，是陈赓把你从阵地上背下来，救了你的命。你现在屁股刚坐稳，就把第一军的共产党员抓起来，你对得起谁？”蒋介石听了，似有所动，“这个”“这个”地支唔了几句，下令把关在造币厂的共产党放了，把缴的枪还给周恩来的卫士。
周恩来见援救共产党员的目的已经达到，就告辞走了。蒋介石望着他气昂昂的身影，感慨地想到：英才啊，英才！为什么杰出的人才都跑到共产党里去了呢。过了一个多月，他在国民党二届二中全会上提出整理党务案，要求共产党员不要跨党，但可以退出共产党，保留国民党党籍。他本想通过这个办法把周恩来、蒋先云、陈赓、聂荣臻这些黄埔军中的共产党员都拉到国民党内来，今后好为他所用。他估计许多共产党员会这么做的，俗话说识时务者为俊杰嘛，现在谁不想抱住蒋校长这棵大树好乘凉。没有想到，此案一出，黄埔军中的四百多名共产党员“哗啦”一下子都退出了国民党，连他最信任的黄埔高材生蒋先云也不要国民党的党籍了。这使他感到非常失望，也叫他可怕。他恨恨地对黄埔军校教育长张治中说：“都退出了好嘛，娘希匹，他们总会有后悔的一天。”
整理党务案后，周恩来再不能担任第一军的党代表了，专门主持中共两广区委军委的工作。这时，两广已经统一，国民革命军即将开始北伐。独立团团长叶挺忙着出征前的准备工作，他的团将担任北伐军的先遣工作。收拾停当后，他正准备和家人聚聚，因为后天部队就要开拔了。正在这时，门外闪进一个人影。叶挺惊喜地迎上去说：“周主任，我还没有去看你呢，你倒先来了，请坐。”周恩来摇摇手说：“不要忙活了，我想和你们团的党员干部见见面，你看方便吗？”叶挺连连答应：“方便，方便。我们本来就受两广区委的领导嘛！”说着命令副官把连以上的共产党员找来。人员到齐后，周恩来站起来说：“同志们，你们心里明白，我们这个团是唯一由共产党领导的武装。革命没有革命军队不行，以后我们还要建立更多的由党直接领导的队伍。我希望你们奋勇作战，打出威风来。”大家听到这里都鼓起掌来。女佣端上酒来，每人拿了一杯。周恩来举杯祝酒：“祝你们克复武汉，饮马长江，干！”说完一饮而尽。军官们也都一口喝下了这杯送行酒，相继离去。周恩来又和叶挺谈了一会儿。忽然两广区委的女同志陈铁军跑来，气喘吁吁地说：“你快回去吧，邓大姐肚子疼得要命。”周恩来一惊，忙与叶挺告别，赶回家去，把邓颖超送到医院。医生仔细地作了检查后，告诉他们说：“太太没有什么病，吃几片药就好了。太太腹中的胎儿是横位，恐怕将来难产，这倒要非常注意。”周恩来点点头，扶着邓颖超回了家。
斗转星移，眼看着到了1926年底。北伐军自7月中旬在广州誓师北伐后，一路势如破竹。叶挺独立团更是能征善攻。汀泗桥、贺胜桥一战，叶挺团如锋利的尖刀，率先突破军阀吴佩孚的阵地，为歼灭吴军主力立下了首功，接着又率先登上武昌城头，克复武汉。这期间他接到了周恩来的信，按信中的批示，扩编了独立团，把两广区委派来的许多共产党员安插到独立团里去。周恩来得到这些消息后非常高兴，他以叶挺独立团为基础建立共产党领导的红色军队的计划正在实现。但是一想到上海陈独秀、彭述之、张国焘等中央领导成员的妥协退让，又感到一种沮丧。正在这时，陈独秀来信要周恩来去中央担任组织委员和军事委员。这是中央的命令，他不得不执行，可是邓颖超怎么办？她正怀着孕，将来还可能难产。邓颖超看出了他的不安情绪，宽慰他说：“你放心地走吧，这里还有妈呢，还有铁军他们。”周恩来到此，也没有好的办法，只好安排了一下家事，便登上了去上海的轮船。这一走就是三个月，音讯全无。直到1927年3月下旬，上海发生了第三次工人武装起义占领了上海，邓颖超才知道周恩来去上海是为了组织这次起义。起义成功了，邓颖超感到很高兴。可是接着她又从报纸上看到蒋介石调二十六军进驻上海的消息，不禁为周恩来的安全担心起来了。北伐以来，蒋介石收买流氓，在九江、安庆捣毁左派领导的党部和总工会，打死打伤共产党员多名。攻下南昌后，又擅自把北伐军总司令部迁到南昌，与武汉的国民政府对抗。现在他又把上海的革命军队调开，专门把由军阀部队收编的二十六军调驻上海，肯定没安好心。
邓颖超的担心并非多余。1927年4月11日，二十六军的一个军官到商务印书馆来找周恩来。这里是上海工人纠察队总部所在地。门口的警卫看了他的证件以后，就把他带到周恩来办公室。这个军官掏出一封信递给周恩来，毕恭毕敬地说：“我是二十六军第二师师部的副官。我们师长怕部队和工人纠察队发生误会，特请周先生到师部一晤。”周恩来看完信笑着说：“原是斯烈师长请我去。我记得他的弟弟叫斯励，是黄埔军校毕业的，是我的学生嘛。好吧，你先到楼下等等，我收拾一下就下来。”副官下楼去了，总部的一个工作人员叫赵澄镜的劝阻道：“周总指挥，现在二十六军处处向我们工人纠察队挑衅闹事，这时候他请你去会谈，恐怕没安好心，你还是不去的好。”周恩来神色严肃地说：“你说的不错。不过斯烈和我既然有他弟弟这层关系，我们还是去和他谈谈。如果能谈出个结果，那也是个好事嘛。”说完就下了楼，和副官坐车到了宝山路第二师师部。斯烈迎出来，把周恩来一行让到客厅，一连声地吩咐勤务兵泡茶递烟，极为诚恳地说：“舍弟常有信来，每每提到周先生对他的教导。我对周先生的人品学问真是敬佩得很，故不揣冒昧，特请周先生来，以便移樽请教。”周恩来说：“建立黄埔军校，培养革命人才。是总理三大政策的结果。我们作为一个革命军人，应该遵从总理遗嘱，顺应历史的潮流，万不可逆历史潮流而动，做对不起总理的事情。”斯烈点点头说：“周先生所见极是，这也是鄙人的想法。”
两人正说着，忽然商务印书馆方向响起了一串急促的枪声，周恩来“霍”地站起来问：“斯师长，这是怎么回事？”斯烈摇摇手说：“周先生，不要紧张。现在上海这么乱，哪一天没有几声枪响。”周恩来一想也对。正迟疑间，一个军官跑来报告：“报告师长，一批流氓和工人纠察队械斗，我们已奉令把双方都缴了械。”周恩来一听，立刻变了脸，指着斯烈的鼻子骂道：“好你个斯烈，背信弃义，言而无信，不如猪狗。”说着就向外走，斯烈也没有阻拦。谁知周恩来还未走出客厅，一批武装士兵冲进来，挡住了他的路，斯烈乘机溜掉。周恩来见自己被骗，气得把屋子里的花瓶什物砸了一地。正在怒不可遏之时，斯烈和二十六军党代表赵舒，工人纠察队总部的黄澄镜进来了。斯烈连声说：“周先生，误会，误会，现在您可以走了。”周恩来怒斥道：“你还自称是总理的信徒呢。什么信徒？是总理的叛徒！你们这样是不会有好结果的。”斯烈说：“周先生别误会，鄙人只不过是奉令行事。”周恩来没有理他，同黄澄镜急步走出这虎狼窝，坐上汽车来到北四川路的罗亦农办公室。在汽车上他才知道，罗亦农知道他被扣后，让黄澄镜找二十六军党代表赵舒，由赵舒说服了斯烈放了他。周恩来听了后悔地说：“这是个教训。我们青年人革命热情很高，但把天下大事看得那么容易，头脑发昏，结果被敌人骗了。我们不能就这样完了，要动员群众，向斯烈施加社会压力，释放被捕工友，发还纠察队枪支。”
当晚，周恩来和赵世炎、罗亦农研究局势。工人们这时已自动集合起来。到第二天，也就是4月12日上午时，闸北青云路广场已聚集了十万工人，浩浩荡荡地向宝山路二十六军二师师部进发请愿。鉴于昨天的教训，周恩来担心游行群众恐遭不测，但为了维护党的威信，他毅然参加了游行。工人们见总指挥来了，非常高兴，意气风发地向宝山路前进。队伍还未走到二师师部便在宝山路三德里被二十六军的士兵拦住了。工人们刚想派出代表和军队交涉，军队突然用机关枪向游行的人群猛扫。宝山路本来狭窄，一下子挤满了10万人，躲都没有办法躲，当场被打死打伤近千人。此日又适逢大雨，雨水和血水混和在一起，宝山路流淌着血的河流。
面对蒋介石暂尽杀绝的残暴政策，是就地求饶，引颈就戮，还是挺起身来，实行武装反抗？
4月16日，由周恩来、李立三、陈延年、赵世炎、罗亦农等人组成的中共中央特委，在上海法租界秘密开会，商讨对蒋介石的新策略。
周恩来首先指出中共的错误和对付蒋介石的根本办法：“我们必须致电武汉党中央，指明：政治上，如继续上海暴动后的右倾错误，是非常危险的。‘四·一二’中可以看出，蒋介石不过是对我们表面缓和，实际是准备整个的打击。但事前武汉与国际都太缓和，没有好好进行反蒋宣传，汪、陈国共宣言不仅毫无积极意义，而且在民众中造成不好的影响，致使此次大受其害。军事上，武汉方面对蒋介石没有积极对付的方案，害怕蒋介石的军事力量，而一味主张北伐，自己完全站到软弱地位上。目前应先解决蒋介石，然后才可以北伐。”
赵世炎语调沉重地点明目前局势的严重性：“目前实为中国整个革命与党的最严重的时期，如果策略稍有差错，关系非常重大。中山舰事件的右倾错误，不过是政权党权的争斗，现在的形势比中山舰事件还要严重。我们再不能有第二个右倾的错误。”
刚从武汉抵达上海的李立三通报了中央的情况。武汉对蒋介石的问题，不但军事上犹豫，政治上也发生动摇。中央认为奉方进攻甚烈，如果蒋介石尚不十分反动，还可姑予敷衍，先行北伐。
罗亦农汇报了4月15日上海区委紧急会议的情况：“区委一致同意恩来对蒋介石的分析。在昨天会议上恩来指出：蒋介石，在宁、沪等地的统治地位并未稳固，死心塌地为他打仗的仅三万人，其他部队如薛兵师、严重师都不愿跟蒋介石镇压人民。如果武汉抓住这一时机发来精兵五万，估计一个月左右即可削平蒋介石。”
陈延年指出：“讨蒋介石的时机，稍纵即逝。应乘资产阶级政权未稳固前打他，才能有胜利的希望。如果再延缓，资产阶级政权已稳固，打起来就十分困难了。”
周恩来最后强调必须从根本上解决中央的错误：“中央政策动摇，指导无方，对于前次广东与这次上海都是如此。对中央的错误，应有根本的解决办法。中央只有完全承认上海与广东两次错误，才能指导全国。”
会后，周恩来亲笔起草给中共中央的意见书，建议武汉“迅速出师讨伐蒋介石”。周恩来列举了蒋介石的种种反革命行径。分析了东征讨蒋的必要性，指出如果不迅速讨蒋，“则蒋之东南政权将益固，与帝国主义关系将益深”。因此“不宜再缓和妥协。上海于暴动后，已曾铸此大错。再不前进，则彼进我退，我方亦将为所动摇，政权领导尽将归之右派，是不仅使左派灰心，整个革命根本必败无疑。”周恩来还解释了讨蒋取胜的可能性：国民革命军主力军队有12个军。9个军表示服从武汉，只有3个军受南京指挥。蒋介石“能直接使用之军仅5个师。”且其中3个师已死伤过半，“在南京者仅为三师、十四师，如何能抗东下之兵？”周恩来最后讲明：“东南军事工作必须有计划、有名义、有负责人、有密函，方能使左派军官要人中央政府也。如何，望与左派同志切实商复为要。”
周恩来为挽救革命危机而提出的对蒋策略可谓高瞻远瞩。可惜，武汉争论的结果，却是否定了这一真知灼见。鲍罗庭与陈独秀作出了符合汪精卫希望同蒋介石妥协的心理的决定——继续北伐。
由于放弃对主要敌人的讨伐，使蒋介石得以站稳脚跟，巩固反革命政权。苏、浙、皖、闽、粤、桂等广大地区均落入他的独裁的魔掌。
5月下旬，周恩来乘搭英国怡和公司的轮船秘密离沪赴汉，继续主持中央军委。这时武汉国民政府虽然在表面上还披着国民党左派的外衣，但还是露出宁汉合流的端倪，周恩来到达武汉，就敏感地察觉到武汉政府将在叛变，国共两党必然分裂，武装斗争不可避免。而陈独秀在右倾错误道路上越滑越远。他一厢情愿地维护与国民党的合作关系，换来的却是一片反共杀声。7月，汪精卫在武汉公开叛变；他咬牙切齿地说：“本人愿为杀共之刽子手焉。”大江南北，血流成河。轰轰烈烈的大革命彻底失败了。
风云突变，烟雨莽苍，中国革命的出路在哪里？鲜血和挫折给人以痛苦也给人以觉醒，它常常出现历史转折的契机。1927年7月12日，共产国际调回鲍罗庭，中共中央进行改组，停止了陈独秀的职务，众望所归的周恩来，被选为新的五人常委之一。7月13日新的党中央召开紧急会议，决定以革命的武装反对反革命武装的新策略。
这时，南昌出现了有利于起义的军事条件，驻南昌的朱培德部队，大部分在吉安、进贤一带，南昌城内兵力单薄。而根据周恩来的部署，受我党掌握和影响的部队，即贺龙领导的第二十军和叶挺领导的第十一军二十四师等，正从武汉开到九江，准备集中南昌。
中共中央接受周恩来提出的在南昌举行武装起义的建议并委派他担任领导武装起义的前敌委员会书记。
7月中旬，贺龙、叶挺的部队从武汉开到九江铁路沿线。汪精卫匆忙于7月24日跑上庐山，和孙科、朱培德、张发奎等密谋策划，企图诱骗贺龙、叶挺上庐山“开会”，以解除他们的兵权。在第二方面军第四军担任参谋长的叶剑英，察觉了这个阴谋，立即秘密会见了贺龙、叶挺。他们在烟水亭附近的甘棠湖面的一条小船上，商讨了对策，决定不上庐山、不理睬要部队集结德安的命令，立即将部队直开南昌。
7月下旬，周恩来仆仆风尘、不顾疲劳和危险，身穿朴素的中山装，手提一个黑色皮包，在陈赓的护送下，从武汉出发，途经九江于26日秘密到达南昌，住进朱德在花园角二号的寓所。周恩来很快了解南昌敌我情况，日以继夜运筹决策，7月27日，在南昌市中心的江西大旅社，周恩来主持了前敌委员会会议，决定成立起义总指挥部，贺龙为总指挥，叶挺为前敌总指挥，于7月30日晚举行武装起义。
在南昌起义临近爆发的紧急时刻，中央常委张国焘从武汉赶到九江，以“中央代表”的身份，接连给前委发来两封密电，说“暴动宜慎重”，要等他到南昌再决定是否起义。7月30日早晨，他赶到南昌，又提出种种“理由”反对起义。周恩来毅然决然地拒绝他的错误主张，指出：“我党应该站在革命队伍领导地位，独立地领导武装斗争。陈独秀已经把我们害得好苦，再按他的主张搞下去，就要招致亡党之祸。暴动断不可推迟，更不可停止，否则将断送革命。必须按计划进行起义。”31日晨，张国焘又以修改起义宣言为借日，企图继续阻挠起义。面对张国焘的无理纠缠，周恩来抽身断丝，激动地对他说：“宣言我来改”。接着，当机立断，签署向国民党反动派打响第一枪的作战命令。
南昌起义的胜利，使国民党反动派的各个集团大为震惊，南京和武汉随即调兵遣将，向南昌反扑，欲置起义军于死地而后快。汪精卫听到南昌起义消息后，从庐山赶回武汉，“心摧发指”地大骂：“一个共产党就和一条毒蛇，一只猛兽一样，决不能听任他留种于人世的。”
因“二期北伐”败绩，引起多方不满，而采取“以退为进”策略，“下野”回到奉化老家的蒋介石，在表面上悠然于山水之间，实际上一刻也未离开中国的政治舞台。周恩来率南昌起义军直指广东，使他心急如焚。蒋介石对于和江西接壤三千余里，历来军政变动互相影响的战略后方广东，从来都不敢掉以轻心；尤其当他确知与自己尚存芥蒂的汪精卫对周恩来挺进广东乐得“拱手相送”时，便立即相应采取措施，急令盘踞两广的国民革命军第八军总指挥李济深加强粤湘边界、粤赣边界警戒，并主动进入赣境，阻截周恩来。李济深把两广反动军队4万人编为左中右三路，由范石生等为总指挥，全力阻击。
南昌起义部队在南一途中，打了一些胜仗。他们一心想打回广东，再次举行北伐，因而没有与农民运动结合起来着手建立根据地。9月下旬，起义部队在潮汕同优势敌军的战斗中失败。
10月3日，前敌委员会在普宁流沙天后庙召开最后决策会议。南昌起义后的周恩来病魔缠身，高烧40度，由担架抬来主持会议。他首先就战事失利作了检讨并部署善后工作：武装人员尽可能收集整顿，向海陆丰撤退，坚持长期斗争；非武装人员按中央指示，分别向海口撤退，然后赴香港、上海。他最后以坚毅的目光巡视大家，说：“我的病不要紧，我不能离开部队，准备到海陆丰去，扯起苏维埃的旗帜！”
在敌人疯狂追捕的艰难环境中，周恩来带着重病之躯转移到海陆丰南塘黄厝寨。周恩来兴奋地说：“这就好了，革命军队和革命群众相结合，南昌起义的革命火焰又要在海陆丰猛烈燃烧起来了。”然而周恩来的病情日益加重，有时因高烧加上发疟疾而神志不清，必须迅速转移到香港就医。10月底，周恩来在中共汕头地委书记杨石魂以及叶挺、聂荣臻等的护送下，乘木船赴香港。
9月底，住在溪口的蒋介石脾气很躁，对亲信侍从往往滥发脾气，妄加指责。有一次，蒋小品烧了一只鸡汁芋头，蒋吃得津津有味，不觉多吃了一些。当他伸手要孟副官添饭时，似觉过饱，就问孟添过几次？孟答已添过两次，蒋介石即离席回卧室休息。一会儿因肚饱难受，他怒气冲冲地将孟叫到卧室大骂：“你是个饭桶！我叫你添饭你就添，难道你没有发觉我吃饱了吗？”有时他心不高兴，就戴着白手套去抚摸窗栏门档角落，发现白手套有些污渍，对着侍从者臭骂一顿，以泄胸中闷气。
10月13日，蒋介石在东京拜会了军国主义团体黑龙会的首领山头满，亲笔书赠“亲如一家”条幅。山头满在回忆这段往事时说：“蒋介石对于共产党，不管在国内或者国外，一定要加以排斥的。”
