实验目的
了解和掌握液体乳、乳粉、罐装炼乳、稀奶油、发酵剂、发酵乳、干酪、奶油、冰淇淋和冷冻甜点的微生物检测方法，监测其卫生质量。
实验原理
在日常生活中，应尽量避免食用生乳或未经加热的含有生乳的制品（如干酪等），因为生乳极有可能成为病原菌的传播媒介。在许多国家，布鲁氏杆菌仍是生乳或生乳制品中最主要的潜在危害。即使生乳来源于没有肺结核和布鲁氏菌病的牛群，仍可能含有其他病原体，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌和一些病原性病毒等。在动物饲料易受霉菌污染的地区，建议用酶联免疫吸附试验试剂盒（ELISA）或用薄层色谱法（TLC）检测饲料中的黄曲霉毒素M1.
实验内容
一、液体乳
（一）液体生乳
此方法适用于待加热生乳卫生质量的评估。
从健康牛的乳房无菌挤出的生乳，每毫升含有几百至几千个细菌，大多是微球菌属和乳类白喉棒状杆菌。非无菌挤乳通常会将许多微生物从外界（如从乳房表面、牛粪、土壤、垫草、饲料等）带入优质乳中。乳挤出之后到加热处理之前有一段延缓期，为细菌的生长和繁殖提供了有利条件。乳中微生物的种类和数量取决于储存温度，若乳被挤出后很快冷却并冷藏保存，假单胞菌属的嗜冷、嗜温菌及某些芽孢杆菌、杆菌会生长繁殖；若延缓期在冷却之前，则乳酸菌会大量繁殖。
从农场抽取的冷藏生乳样品，30℃下的需氧嗜温细菌数量应小于104个/mL；而乳品加工厂大量冷藏的原料乳，30℃下生长的需氧嗜温菌数量应小于105个/mL。多数情况下生乳的检测（如显微镜检查）主要是针对乳腺炎进行的，最好对农场乳牛逐一抽样进行检验。细菌计数等检测项目是用于生产和储存卫生质量的评估。
1.乳腺炎的检查
多数用于牛乳腺炎诊断的实验室方法都能用于检测牛乳的品质变化，这种品质变化往往是由于牛乳受到微生物的污染所造成的。同时细菌培养法也被尝试着用于病原菌的分离，这种方法也能用于抗生素的药敏实验。在抽取牛乳样品进行细菌检测前要先对挤乳者的手和牛的乳房进行清洁和消毒，这一点非常重要。将开始挤出的乳弃掉，中段乳直接挤入一个无菌样品瓶。初步普查的牛群，可分别取1/4样品混合后进行详细的调查，应从可疑的群体中抽取1/4样品，单独检测。当牛或乳呈现亚临床症状（隐性感染）即无肉眼可见的异常现象时，实验室检测尤为重要。
（1）血球计数板计数 健康乳牛的乳中也含有一些细胞，主要是上皮细胞和少量的白细胞；患有乳腺炎的牛产的乳，因乳房发炎会导致白细胞数量的剧增。在泌乳早期、晚期的乳中，细胞数量也会有所增加，但这往往是因为上皮细胞的数量增加而引起的。细胞计数的操作步骤如下：
①全脂乳检测中，在用亚甲基蓝、改良的Newman染色剂（见附录II）对样品着色前，对牛乳涂片进行脱脂十分必要。干燥的涂片需着色10min，之后烘干，在水中清洗，之后再烘干；
②配方中用作脱脂剂的1，1，2，2-四氯乙烷，也可用毒性较小的1，1，1-三氯乙烷代替此试剂。操作时应使用通风橱，以免吸入有害蒸气；
③体细胞和微生物染色后呈蓝色。
判定标准。
（2）Whiteside黏度试验 这是诊断乳腺炎的一种简单、快捷、间接的测试方法，也是一种估计牛乳中细胞数量的间接方法。在患乳腺炎牛的乳中，当细胞数量很大时，用碱滴定乳液，细胞中释放出的核酸能产生明显的黏度。其操作步骤如下：
①乳样需一直保持在0～4℃，并需在收乳后36h之内进行检验；
②以低温（4℃，预先冷藏）无菌滴管在玻璃盘或碟中滴加被混合好的乳液或乳房分泌液5滴，以无菌冷水（4℃，预先冷藏）洗净滴管，备用；
③另取预冷至4℃的1mol/L NaOH溶液在乳样上滴加1滴；
④用预冷的灭菌玻璃棒慢慢均匀混合，使其成为4cm2的面积，20～24s内观察现象。记录黏滞性产生的情况。随细胞数量的增加黏滞性增强，若无黏滞性增强，则记录为阴性，表明牛乳正常。
（3）培养检测法 引发乳腺炎的微生物分离通常是用划线或倒平板技术从单个1/4样品中得到的，所用的培养基应适合大部分乳腺炎微生物的生长，必要时用选择性培养基分离特殊菌种。最好的非选择性培养基是5%血琼脂（培养基100）。
Edward七叶苷结晶紫血琼脂培养基（培养基79）是一种选择性培养基，能用于乳腺炎链球菌的分离。选择性试剂为结晶紫，其使用浓度为1：500000.链球菌可在该培养基上生长，而葡萄球菌等则受到抑制。乳腺炎链球等发酵七叶苷的微生物能产生黑色菌落，而不发酵七叶苷的微生物（如无乳链球菌和停乳链球菌）则产生无色菌落。
化脓性链球菌的另一种选择性培养基是磷脂酰乙醇胺黏菌素1，2，3，4-萘四酮酸血琼脂培养基（COBA）。1，2，3，4-萘四酮酸是一种与萘啶酮酸相似的抗菌成分，能抑制革兰氏阴性菌和葡萄球菌。
①分离步骤：用4mm接种环将0.01mL乳划线于预先准备好的干燥血琼脂平板表面，当检验取自同一个乳牛的4个1/4样品时，在同一平板的不同区域划线。37℃培养48h，在24～48h进行检测。因接种时使用的是固定的数量，因而可与单个1/4样品进行比较，记录所有的溶血菌落。
分离平板上生长的大部分菌落为可疑菌。记录具有代表性菌落的形状、大小、溶血（如果有）、着色、革兰氏反应和形态，这些观察结果能确定菌株的种类，但必要时还需做进一步的测试。此时对可疑的葡萄球菌进行载玻片凝固酶测试非常方便。阳性反应表明存在金黄色葡萄球菌；可疑链球菌需进行生理试验。
如果检测出引发乳腺炎的致病菌，表明乳牛可能发生了临床或亚临床的乳腺炎，这时需进一步检测该致病菌对抗生素的敏感性。
②药敏试验：抗生素的选择对乳腺炎的治疗非常重要。从患病乳牛的牛乳中分离的致病菌纯菌株可用于药敏试验。
将分离的致病菌接种到适当的肉汤培养基中，37℃培养24h。将0.1mL培养物接种于预先铺好并干燥的琼脂平板上（葡萄球菌可用营养琼脂，链球菌可用酵母膏葡萄糖肉汤琼脂），用无菌棒涂布平板，放至微干，用纸片分放器在琼脂表面放置一系列适当的抗生素纸片（也可使用经火焰灼烧过的无菌镊子）。
37℃培养24h，记录纸片周围的抑菌圈直径。抑菌圈的大小表明菌株对特定抗生素的敏感程度，对于乳腺炎的治疗十分重要。但应注意：纸片周边出现较大抑菌圈的抗生素，其疗效并不一定比产生小抑菌圈的抗生素疗效好，因为很多因素会影响抑菌圈的大小，这种方法通过抗生素的抑菌圈检测其最小抑制浓度。
2.生乳的卫生质量
刃天青试验或亚甲基蓝试验可用于非冷却生乳中嗜温菌的检测，但这些试验不适用于农场冷藏罐或运输过程中所用的储藏箱中乳的检测。对于冷藏的生乳，目前使用5℃和30℃菌落计数和耐热菌计数可以很好的评估这些产品的质量，然而，用计数法进行这些产品的日常质控显然是不可行的。
（1）需氧嗜温菌计数 参见第二章实验14.
（2）大肠菌群计数 参见第二章实验15.
（3）还原试验 常用的染色剂是亚甲基蓝和刃天青，有时也使用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）。参见第二章实验16.
（4）实验室巴氏杀菌试验 在实验室对少量乳液样品进行巴氏杀菌。杀菌时采用与巴氏杀菌相同的时间和温度组合。经灭菌后残存的微生物均被认为是耐热菌。用平板计数琼脂分离耐热菌，分离菌株耐热性可用D值法确认。嗜温性耐热菌的分离通常在30℃进行，因为在37℃时某些耐热菌（如微杆菌）生长过快或根本不生长。
热处理之后菌体数量的减少可用与原数量相比的百分数来计算（百分率减少），样品中含耐热微生物的数量较少时，百分率减少较大，而含耐热微生物的数量较多时，则百分率减少较少。其操作步骤如下：
①将样品混合，然后取10mL于无菌试管，用无菌橡皮塞塞紧。
②将试管翻转，并以其塞子为支撑将其完全浸入（63.5±0.5）℃旋涡水浴中约35min，其中包括使牛乳温度达到63.5℃的5min时间（应对水浴快速达到63.5℃的能力进行测定），或先将对照管放入，当达到要求的巴氏杀菌温度后再放入其他试管，在水浴中保持约30min。
③试管从水浴中取出，在冰浴中快速冷却。
④将试管翻转3次将内容物混合，然后制备10倍稀释的溶液至10-3，或按要求制备。
⑤用酵母膏牛乳琼脂或平板计数琼脂上倒平板，30℃培养3～4d。
（5）芽孢杆菌的计数和耐热芽孢杆菌的检测 参见第二章实验27.
（6）嗜冷菌计数 参见第二章实验28.
世界各国都对生鲜牛乳的卫生指标进行了规定，但不同国家有所差异。为国际上对用于待加工的原料乳规定的一些指标。一般地，每抽检的5个样品中，至少有4个的样品微生物指标低于表中规定的最大允许量；只要有一个超过规定的上限就应严格控制，甚至处罚。为我国原料乳的细菌标准。
3.乳质欠佳和变质的检查
当一些特定的微生物生长到一定程度时，就会产生代谢产物并发出怪味，造成乳的品质欠佳，严重时发生变质。这说明乳已经被微生物严重污染。当乳的物理性状发生变化时常使用“欠佳”一词；而当物理状况正常，但产品的口味或气味不良时，则应使用“变质”。
（1）腐败微生物的分离 检查乳样品，取几毫升加入平皿中，观察乳的物理性状。用试纸测定其pH，制备涂片，用Charlett的改良Newman染色剂或革兰氏方法对涂片染色后（先用二甲苯将涂片脱脂，染色前将涂片上的水控干，并在空气中干燥）镜检。应当注意的是二甲苯和Newman染色剂易挥发，且有刺激性，应在通风橱中操作。
取一环乳液，在非选择性培养基――酵母膏乳琼脂（培养基61）、合适的选择性培养基和其他适合于可疑微生物生长的培养基上分别划线。划线后置于4.5～63℃的温度下培养，该温度范围包括了检测前样品的储存温度。培养后，挑选可疑菌落，重新划线，进行纯培养，然后对菌种进行鉴定。还可将纯菌株接种于无菌乳液中培养，检查纯菌株对乳的腐败作用。若再次发生乳液品质欠佳或变质时，就证明分离到了致腐微生物。
（2）乳品品质欠佳
①酸乳（Sour milk）：鲜乳在乳糖发酵菌（乳球菌和产气杆菌族）作用下产生乳酸，引起乳汁凝集。在新鲜的酸乳中，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）约占整个菌族的90%。在酵母膏乳琼脂（培养基61）、酵母葡萄糖肉汁琼脂（培养基82）或中性红白垩乳糖琼脂（培养基21）上划线，能分离到乳酸乳球菌。在制备平板时在培养基中加入1：2000的乙酸铊能够有效抑制革兰氏阴性菌的生长，有利于该菌的分离。
②产气或起泡乳（Gassiness or frothiness）：牛乳表面产生气泡，有时渗透到乳脂中，最常见的致变微生物是产气肠杆菌，尤其是产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）和发酵乳糖的酵母菌。紫红胆盐琼脂（VRBGA）（培养基83）能用于分离肠杆菌科细菌，酸化PDA培养基（pH3.5）（培养基28）用于分离酵母菌。
③甜块或甜性凝集块乳（Sweet dotting or sweet curdling）：由于蛋白水解酶的作用，当pH接近中性时，产生凝集。主要是由芽孢杆菌（Bacillus spp。）引起的。这类乳质欠佳常发生在经热处理的乳中，原因是竞争性细菌的消除或芽孢被热激活。
④黏稠或发黏乳（Ropiness or sliminess）：用接种环能将乳拉成细丝。主要是由带荚膜的微生物生长所引起的，常发生在冰箱冷藏乳中，诱变微生物主要有产气肠杆菌中的荚膜菌，如产气克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）、黏乳产碱杆菌（Alcaligenes viscolactis）、微球菌（Micrococcus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的荚膜菌。这些菌的菌落也显示出黏性。
⑤“碎”乳脂乳（‘Broken’cream or bitty cream）：这种乳表面的乳脂分裂成碎片且不能重新乳化。当将这种乳倒入热茶或热咖啡中时，这种现象就更明显。这种品质欠佳乳是由蜡状芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌霉菌变种产生的卵磷脂酶造成的。用卵黄琼脂（培养基87）可从加热或未加热的乳中分离到这些细菌。若样品中菌体数量较少，可采用MPN法进行计数，参照石蕊牛乳法的操作方法和数量稀释溶液，25℃培养，然后从每个试管取一环培养物划线于卵黄琼脂，检测卵磷脂酶的产生。
（3）牛乳变质 应特别强调的是将乳稍加热，便能辨别牛乳是否变质。这是一种最为简单的判断方法。繁殖（propagation）测试可用来确定变质是否是由微生物所造成的。
将约5mL变质的牛乳加入50mL无菌的全脂乳溶液中（预先装在一个带玻璃塞的瓶中），15～25℃或其他适当的温度下培养，每天检查2次，观察乳是否变质。只有当样品中的变质是由微生物引起的时，才会引起全脂乳溶液的变质的发生（如繁殖）。
①麦芽或焦糖变质（Malty or caramel taint）：由乳酸乳球菌生麦芽变种（Lactococcuslactis var。maltigenes），这个变种菌不同于乳酸乳球菌这种非麦芽菌株，它能分解酪蛋白中的亮氨酸产生3-甲基丁醇。
②酚或酚类物变质（Carboic or phenolic taint）：常发生在商业无菌的瓶装乳中，是由产酚的环状芽孢杆菌（B。circulans）所引起的，这种菌的芽孢在受热后能够生存。
4.乳中抗生素的检测
治疗牛乳腺炎所用的抗生素会残留在乳中，饮用后会造成过敏反应，人体耐药性增强等症状，不利于公众健康。另外，残留的抗生素会干扰乳制品的乳酸发酵，不利于发酵乳、干酪、熟乳脂等的制作。一般在使用抗生素后48～72h，其浓度会逐渐消失。但问题在于，治疗后的这段时间不给患病乳牛挤乳是不切实际的。
现在已经研制出几种检测牛乳中痕量抗生素的微生物测试方法，这些方法灵敏度很高，多通过残留抗生素对敏感菌株生长的抑制情况进行检测结果的判断。但阿莫西林等β-内酰胺类化合物除外。对于这些抗生素，为防止假阳性反应的发生，通常不检测其抑制特性，而检测其中的β-内酰胺酶。因为菌株的抑制剂除抗生素外还有去污剂或消毒剂等其他物质。噬菌体或其他热敏性抑制剂可能产生假阳性结果，在确认试验前对样品进行热处理便可以排除。这类试验通常有对比结果，所以必须按要求规范实验操作。方法中测试的灵敏度和痕量抗生素的检出限取决于特定测试条件下选用菌株的敏感性。常用的对乳中抗生素的常规分析方法是纸片分析法和染色剂还原法。本书对这些方法举例进行了描述。另外，也可使用快速现场测试法，这些方法可用于农场或平台放行检测。检测β-内酰胺抗生素的SNAP测试可在10min内得到检测结果。
（1）片碟法 将敏感菌株接种于琼脂培养基后倾倒平板，并使之凝固，然后将浸泡在样品中的小圆形滤纸片放在琼脂表面。将平板置于适当的温度下培养，直至长出菌落。若有抗生素或其他抑制物渗入培养基，则在纸片周围会出现清晰的抑菌圈。通过与已知对照平板抑制圈直径的比较（条件是严格的标准状态），可得到牛乳中抗生素的含量。所有敏感菌株均可用于此项试验，如藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌等。
β-内酰胺酶能使乳中的β-内酰胺失活，可用于证明β-内酰胺中抗生素的存在，检测时，在样品中加入β-内酰胺酶，或用β-内酰胺酶的纸片蘸取测试乳样品。其操作步骤如下：
①在不含抗生素的乳中按所需浓度加入青霉素溶液，使对照中抗生素浓度与测试的检出限制水平一致。以此作为对照管。另外，检出限还取决于所用菌株的敏感性。使用枯草芽孢杆菌时，对照管中培养基青霉素的含量为0.05IU/mL；使用嗜热脂肪芽孢杆菌时，青霉素含量为0.02IU/mL。
②在40～50℃时，将1mL处于指数生长期的营养肉汤培养物加入5mL熔化的营养琼脂培养基中，然后倒入培养皿，置于操作台上使之凝固，按要求标记底板。
③使用洁净干燥的镊子，将一片无菌空白抗生素纸片浸入充分混合的样品中，控掉多余乳液，将纸片放在平板中合适的位置。冲洗，擦干镊子，进行对照和其他样品的测试。
④将平皿置于适当的培养温度（30℃培养枯草芽孢杆菌或50℃培养嗜热脂肪芽孢杆菌），直到生长出菌落或培养至规定的时间。
⑤检查平板，将样品的抑菌圈直径与对照进行比较，当样品的抑菌圈直径小于对照时，样品合格；当样品的抑菌圈直径等于或大于对照抑菌圈直径时，且经β-内酰胺酶处理后样品的抑菌圈直径小于未用β-内酰胺酶处理的样品抑菌圈直径时，样品中含有β-内酰胺类抗生素。当样品抑菌圈等于或大于对照时，用β-内酰胺酶处理后样品抑菌圈的大小不变，则应将样品加热，破坏样品中的其他抑制物质，然后再次检测（或将未经加热和加热的样品同时检测）。若样品中抑制物浓度等于或大于对照浓度时，则试验失败。
（2）染色剂还原试验 参见第二章实验17.
（二）热处理乳
这里的热处理是指在60～65℃下加热约15s。新鲜的生乳经过热处理后，能够延长保存期，使生乳在被进一步加工之前能够延长冷藏储存的时间。这种处理方法能有效减少假单胞菌（Pseudomonas）等热敏性嗜热菌的数量。但假单胞菌能在生乳冷藏期间生长，产生胞外酶（如蛋白酶和脂肪酶），这类酶不受随后的热处理的影响，能继续保留在乳液中，产生类似UHT乳或干酪样的腐败现象。
（三）巴氏杀菌乳
乳的常规微生物测试一般需1～2d才能得到结果，很不适用于这种极易腐败产品的质量控制。这类产品的质量控制应在进行巴氏杀菌后，用磷酸酶试验进行验证。
然而，很多经过巴氏杀菌的乳也很容易造成巴氏杀菌后污染，导致沙门氏菌或弯曲杆菌肠炎的暴发。一个分流阀的狭缝污染造成了疾病的暴发；菌体污染了与清洁的环路连接的管道的阀门也曾引起过疾病暴发。这都是因为极少量污染了致病菌的生乳进入巴氏杀菌乳，而磷酸酶试验又检测不到这类污染，从而造成疾病的暴发。巴氏杀菌后的乳加入其他风味饮料或热敏成分同样可能造成污染。
因此，除了可用于质量控制的磷酸酶试验外，微生物评估也能起到保证质量的作用，它通过对产品的生产、发放和销售的评估，来确定下一批产品是否合格。显然，此时使用控制流程图十分有用。
在30～32℃进行需氧嗜温菌计数，也可进行大肠杆菌或总肠道菌计数。我国对于巴氏杀菌牛乳的微生物标准。
英国相关标准规定：巴氏杀菌后，总活菌数不能超过30000个/mL（新鲜巴氏杀菌乳应小于5000个/mL）。在1mL产品中应检测不到肠道菌（或大肠杆菌）。
巴氏杀菌乳在食用前冷藏保存，所以30℃需氧嗜温菌计数会有所增加（在30℃下培养时还可检出多数嗜冷嗜温菌）。但在保存良好的巴氏杀菌乳中，大肠杆菌和其他肠道细菌不应当增加。所以在批发零售的乳标准中，不允许这些菌增殖。
（四）UHT（超高温灭菌）乳和无菌乳
这些商业无菌乳在适当预增菌后，按照下列操作步骤检测。
1.耐热性嗜热菌（在55℃）计数
如果在生乳中存在大量的芽孢，那么在热处理后仍能检测到残存的微生物。
2.嗜温菌（在30℃）计数
乳加热后被再次污染时才存在。
英国的UHT乳标准为：在密闭的容器中30℃下培养15d，和55℃下培养7d后，30℃时的平板计数每1mL应小于或等于100个菌。
我国的UHT牛乳微生物标准对于耐热芽孢并没有规定。
二、乳粉
乳粉加工前生乳的热处理和干燥方法与乳粉中微生物数量有直接关系。经较严格的热处理（例如滚筒干燥）的乳粉要比低温干燥（例如喷雾干燥）处理乳粉的微生物菌落数少。喷雾干燥的温度不能杀死污染菌，甚至对沙门氏菌等热敏的致病菌也无能为力。因此，喷雾干燥的乳粉首先要用巴氏杀菌，而且还要确保在灭菌后和干燥时不造成再次污染；更为重要的影响因素是乳粉厂的污染程度和干燥前菌体繁殖的状况，另外，凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的数目也非常重要，其产生的内毒素量应不足以威胁人类健康。乳粉装袋时会发生再次污染，尤其是酵母菌和真菌等需氧菌的污染。在储存过程中，乳粉中所有残存菌或污染的菌都会慢慢死亡，除非乳粉中含有足够其生存的水分。但不应将长期储存作为消除产品污染的方式，因为乳粉冲泡后，残留的微生物还会生长。所以，冲泡乳的保存期并不比鲜乳的长。
经常发生沙门氏菌食物中毒的乳粉加工厂要认真实施危害分析关键控制点（HACCP）计划。因为这些食品常引起国际性的食物中毒。
（一）取样
乳粉的标准取样程序是将距顶部150mm深的乳粉混匀，用一个干燥、无菌的金属铲或金属勺移取不小于115g的样品，放到一个无菌的样品罐中，样品罐应足够大，使样品能够充分摇动混匀。如果需要得到更多袋装乳粉的表面和表面下的信息，则应分别取样。
（二）显微镜检查
参见第一章实验7.
（三）菌株的检测
（1）需氧嗜温菌计数 参见第二章实验14，培养温度30℃、37℃和55℃分别培养5d、3d和3d。
（2）大肠菌群计数 参见第二章实验15，培养温度30℃。
（3）肠球菌 参见第二章实验29.
（4）酵母菌和霉菌检测 参见第二章实验14.
（5）金黄色葡萄球菌 参见第二章实验21.
（6）芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 参见第二章实验27.
（7）芽孢梭菌 用普通营养琼脂平板计数在30℃、37℃和55℃厌氧培养3～5d，产气荚膜梭状芽孢杆菌用MPN法计数。
（8）沙门氏菌 参见第二章实验18.
（四）结果和推荐标准
记录每1g乳粉的检测结果。对于刚喷雾干燥后的乳粉样品用显微镜直接计数法，乳粉中细菌数应小于106个/g；用一般的计数法，应小于104个/g。乳粉中大肠产气菌、酵母菌和霉菌，均应小于10个/g。乳粉中金黄色葡萄球菌应低于10个/g，而100g乳粉中不得检出沙门氏菌。对于用一般的计数法检测的经滚筒干燥的乳粉样品，样品中的细菌总数应小于100个/g，需氧杆菌、酵母菌和霉菌，均应小于10个/g。
（1）国内标准 我国对全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂甜乳粉、婴儿配方乳粉I、II、III的微生物指标分别有相应的规定。
（2）国外标准 目前国外也没有统一的卫生标准，一般常见的推荐标准。
三、罐装炼乳
炼乳既包括不甜的无糖炼乳也包括加蔗糖的甜炼乳。
（一）无糖炼乳
为保证质量，确保产品在加热处理后不被再次污染，装乳的器具应进行有效地灭菌。但若包装不严则极易造成乳的再次污染。在冷水中加入氯霉素，可以防止潜在致病菌和腐败微生物的污染。这些微生物在形态上与其他密封好的产品中的微生物是一致的。
1.罐头的保温
取代表性的罐头样品在5℃培养7d，35～37℃保温14d，或在25～27℃保温1个月。保温后检查罐头，罐头中如有产气微生物，就会鼓罐（如爆裂）。因此很容易识别。
2.乳中细菌的检测
准备好罐头，按下列操作无菌打开：摇动罐头使内容物充分混匀，去掉标签，用温水清洗罐头的表面，洁净的纸巾擦干后，再用含有适当消毒液的海绵擦拭并干燥，然后点燃酒精棉球擦拭穿刺面，用无菌的开罐器将其打开（操作时一定要小心，防止罐头爆裂），取样后用灭菌的培养皿盖盖住。
3.镜检
制备乳涂片，用革兰氏法染色后镜检。需要时可先用二甲苯脱脂（在通风橱中操作）。
4.培养检测
分别取1mL乳汁样品加入Crossley乳蛋白胨培养基（培养基59）和10mL熔化的酵母葡萄糖肉汁（培养基82）琼脂，摇动试管。另取1mL样品加入平皿中，再加入酵母膏乳琼脂或平板计数琼脂。置于适当的温度下培养（可使用罐头保温的温度）。
如果镜检正常，且1mL样品中没有微生物，则认为罐头已经灭菌干净。
（二）甜炼乳
浓缩甜炼乳糖分高和水分活度低，能抑制其中微生物的代谢和繁殖。但它并非无菌产品，该产品中存在的主要微生物是腐生菌，其中高渗和耐渗的酵母菌和霉菌会使产品腐败变质。即便在合格的罐头产品中也存在有需氧或兼性厌氧霉菌，这主要是由于罐头内部不能完全装满而留有较大的热空间，给生长于产品表面的霉菌提供了氧气，典型的霉菌生长会生成“钮扣”状密集菌丝。每1g甜炼乳中的需氧嗜常温菌应小于100个/g，脂解计数小于10个/g，酵母菌、霉菌和大肠菌群均小于1个/g。
1.罐头的保温
甜炼乳罐头产品黏度很大，为降低黏度，在开罐前，应在45℃的水浴中加热，时间不应超过15min。然后按前文介绍蒸发乳的开罐法无菌开罐。
2.菌株的检测
用一支10mL无菌的大口径移液管，移取10mL乳到无菌样品罐中，在37℃加入90mL稀释液，振摇25次。按常规法稀释至10-3，从每个稀释度中取出1mL放入适当的培养基中，具体操作如下：
①需氧嗜温菌计数：使用普通营养琼脂平板计数，30℃培养3d。
②脂解菌计数：用三丁酸甘油酯琼脂（培养基49），30℃培养3d。
③肠道菌或大肠菌群计数：用结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）或结晶紫中性红胆盐乳糖琼脂（VRBLA）（培养基83），30℃培养24h，若样品中细菌量较少，可以用MPN法。对照MPN值，若得出阳性结果，从阳性管中取一环培养物在类似的培养基或麦康凯琼脂上划线接种。
④酵母菌和霉菌计数：参见第二章实验14.
3.结果和推荐标准
记录浓缩乳的结果甜浓缩乳中的活菌计数应小于100个/g，脂解菌计数应小于10个/g，酵母菌、霉菌、肠道菌总数或大肠菌群均应小于1个/g。
我国的炼乳标准对微生物指标的要求。
四、稀奶油
稀奶油中的微生物与原料乳中的相似，即在原乳中存在的微生物也会存在于稀奶油中，但热处理后残留（例如灭菌或雾化）和加热后再次污染的微生物，均会影响其保质期。尤其是那些随后的储存温度不能抑制生长的微生物危害更严重。所以专家建议最好不要食用生奶油。
从微生物学的角度看，奶油在巴氏杀菌前应先进行均质，但与杀菌后均质相比，先均质更易激活乳脂酶的活性而导致产品的腐败变质。因此，均质也会造成微生物的污染。用罐头、瓶子或纸盒包装的杀菌乳油几乎不存在活菌。其检测方法可参照蒸发乳的食品无菌测试，而通常不使用下文介绍的鲜奶油的测试。
（一）取样
单独抽取一盒或一袋样品，或用无菌长柄勺从大量散装样品中取样，应装满无菌的样品罐，如果2h内不能将样品送到实验室，应该在取样当日17：00以前将样品送到实验室。检测前，样品应储存到冰箱中。
（二）菌株的检测
用9mL常用的稀释液做10倍稀释直至10-4，或按要求稀释。然后按下列操作进行：
①用普通营养琼脂进行需氧嗜温菌计数，30℃培养3d。
②用结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）或结晶紫中性红胆盐乳糖琼脂（VRBLA）（培养基83）进行肠道菌和大肠菌群计数，30℃培养24h（或用MPN法）。
③金黄色葡萄球菌检测：参见第二章实验21.
④用三丁酸甘油酯琼脂在4.5℃和30℃分别培养14d和3d，进行嗜冷营养脂解菌计数和一般的脂解菌计数。
⑤沙门氏菌：参见第二章实验18.
⑥单核细胞增生李斯特氏菌的检测：参见第二章实验25.
（三）结果和推荐标准
记录每1g奶油的计数结果，巴氏杀菌后的稀奶油每1g所含需氧嗜温菌应小于10-4个。我国标准对巴氏杀菌后的稀奶油规定。
五、乳品发酵剂
在乳品工业中，发酵菌种通常指的是牛乳中的乳酸菌。在乳制品的发酵生产中，乳酸菌能促使乳品中的乳酸发酵。发酵乳制品的品质取决于发酵菌种的活性和纯度。因此，必须对发酵菌种进行质量评估。在选择发酵菌种的乳酸菌时，必须考虑不同的发酵用途。制造干酪时，主要应考虑乳酸菌的活性。可以用乳酸乳球菌（乳亚种或乳脂亚种），也可以用两个亚种的混合物。传统的生产工艺是将发酵菌株的液体菌种作为母种保存，使用时用母种转接次代菌株，大量培养后再接种于大量的牛乳中，用于大量产品的生产。这种多步骤操作很容易造成产品中细菌或噬菌体的污染，也可能造成发酵菌种的变异，这种变异有时是有害的。所以对于发酵菌株，建议使用下面介绍的质量保证检查程序。
发酵菌种的活性试验可以确定乳酸菌是否有足够的活性。改良的活性测试试验能检测到干酪乳清中的噬菌体。用低钙“噬菌体抑制培养基”可降低乳发酵菌株培养时的噬菌体的增殖。这种培养基可以购置，也可以用磷酸盐作为隔离剂获得。在脱脂乳中加入20g/L的磷酸钠能抑制噬菌体的生长，而发酵菌种则能正常生长。另一种抑制噬菌体生长的方式是使用抗噬菌体的菌株。
这些发酵产品的特殊要求是产品要有芳香味，例如用成熟的乳生产奶油时，应加入发酵柠檬的菌种。如乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种，或乳酸乳球菌丁二酮亚种、乳明串珠菌或乳脂明串珠菌等，这些菌能产生二乙酰。V-P试验可用来检测培养物产生3-羟基丁酮和二乙酰的能力。
如今，现代化的生产企业一般不再保存发酵菌种，而是根据生产的需要购置冻干的或液氧罐保存的菌种。这些菌种可以制备大量发酵菌种。另外，一些市售的高浓度的发酵菌种也可直接接种到干酪中，很显然，用菌株直接接种减少了其他菌或噬菌体的污染。
（一）显微镜检测
将涂片用革兰氏染色后镜检。制备脱脂乳的涂片时不需要二甲苯脱脂，注意球菌对和球菌链数量上的相对差异，若发酵培养物中有长链球菌生长，表明产品中有乳酸乳球菌乳脂亚种。
（二）活性试验
将1mL的发酵菌株加入100mL培养液中，30℃水浴中放置6h。培养后，检查酸度的变化，将lmL 0.5%的酚酞指示剂加入10mL培养液中，用0.1mol/L NaOH溶液滴定至溶液呈浅粉色。将消耗NaOH的体积（以毫升计）除以10即可得到培养液的酸度。
（三）改良活性试验（检测噬菌体）
在2个装有100mL灭菌乳的烧瓶中分别加入1mL发酵菌种。其中一个烧瓶加入0.1%的乳清（1mL 1：10的稀释液），另一个烧瓶加入1mL稀释液作对照，30℃水浴中培养6h。
按活性试验方法检测每个培养液的酸度，如果加入乳清的培养液的酸度比对照高不到10%，即认为乳清中含有会影响发酵菌种的噬菌体。
（四）生化试验
从发酵菌种的外观通常可以判断它的质量，而简单的生化试验可以证实判断的正确性。
1.过氧化氢酶试验
在装有5mL发酵菌种的试管中加入1mL的过氧化氢。乳酸菌为试验阴性，若试验结果为阳性表明已被污染。
2.V-P试验
在2.5mL发酵菌种中加入V-P试剂，充分摇动，使其混合，如30min内有粉色出现，则反应呈阳性。
（五）菌株的检测
1.活菌种发酵计数
（1）显微镜直接计数 参见第一章实验7.
（2）发酵剂活菌计数 参见第二章实验32.
2.污染的检测
大多数情况下，将0.1mL的发酵菌种接种到适当的选择性培养基中，进行微生物污染的检测。如要需要定量分析，则在每个已制备好的10倍稀释液中取1mL进行以下检测。
（1）酵母菌和霉菌的检测 参见第二章实验14.
（2）除乳酸菌外的其他菌种的检测 使用营养琼脂（或者类似的不含发酵的碳水化合物的非选择性培养基），30℃下需氧和厌氧各培养3d。
（3）肠道菌或大肠菌群检测 参见第二章实验15.
（4）用半固体柠檬酸乳琼脂检测柠檬酸发酵微生物――乳酸乳球菌乳亚种和/或乳酸乳球菌乳脂亚种，如有气体产生表明柠檬酸发酵。培养基的制备如下：用1%（0.1mL）的发酵菌种接种柠檬酸乳（取0.5mL，10%的柠檬酸钠溶液加入10mL乳中），在48℃加入4mL，熔化的2%琼脂中。倒置混匀，30℃培养3d。在特定条件下，存在于发酵菌种中的这些菌株对干酪加工是有害的。它们存在于干酪发酵时产生的气孔中，发酵柠檬酸产生二氧化碳。
（5）特殊的致病菌的检测 如金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌等参见第二章实验18、21和25.
（六）纯发酵菌的分离和保存
1.菌种分离
参见第二章实验35.
2.菌种保藏
参见第二章实验33.
（七）青霉素对发酵剂影响验证实验
将待测培养物接种到含有系列浓度青霉素的石蕊乳培养基培养后，从石蕊乳外观变化判断抑制作用是否发生，其操作步骤如下：
（1）在100mL无菌蒸馏水中加入一片10000IU的氨苄青霉素，放置15min，摇动使其溶解，制成100 IU/mL的青霉素原液。
（2）将原液梯度稀释成每1mL含10、1、0.1 IU的青霉素溶液，加入装有9mL无菌石蕊牛乳的系列试管中，使青霉素的浓度系列为10～0.001 IU/mL。
（3）在每管中接种一环培养液，在适当温度下培养过夜：乳链球菌和发酵菌种在30℃培养，链球菌嗜热链球菌和酸乳菌在37℃培养。同时用一个未接种石蕊乳培养基的试管作对照。
（4）记录培养结果 对照管产酸，而被青霉素抑制的管不产酸。嗜热链球菌是对青霉素最敏感的微生物之一，因此可被用于做青霉素检测试验。因为它是酸乳的发酵菌之一，所以发酵乳产品中的菌株对乳中残留的抗生素十分敏感。
（5）取对照管及不产酸试管中的培养物，制成涂片，革兰氏染色后镜检。注意对照管和抑制管中菌种形态上的差别。由于青霉素的存在，球菌有向外延伸成杆菌的趋势，记录出现这一反常现象的稀释度。
六、发酵乳
当乳中的乳酸菌生长到一定量时，乳就会浓缩或变稠，形成发酵乳，它具有典型的酸味。当存在于生乳中天然的乳酸链球菌占优势时，就会自然发生这种现象。但大规模生产的合格的发酵乳通常需加入发酵菌种。
当乳中的乳酸菌占主导位置时（如在酪乳中），乳就变成了酸乳。这种所谓的生物活性酸乳在许多国家都很受欢迎。生产菌株除德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌外，还可以加入合适的菌种（例如双歧杆菌和嗜酸乳杆菌）或使用益生菌。
在发酵乳中能大量繁殖的酵母菌对酸乳和酪乳的生产是不利的。最初产品中存在少量污染的酵母菌，在加工过程中不断繁殖，使产品产生大量泡沫并导致其风味消失。
（一）显微镜观察
参见第一章实验7.
（二）发酵菌种的分离
参见第二章实验35.
（三）结果和推荐标准
我国标准对酸牛乳规定。
七、干酪
干酪类发酵食品中含有大量的乳酸菌，微生物在整个发酵过程中起作用。加工后短期内，乳酸菌在产品中占主导地位，不成熟的软质干酪（如农家干酪）中就含有大量的乳酸菌。在干酪成熟的过程中，乳酸菌等发酵菌种逐渐被耐酸的乳杆菌所取代。在许多硬质干酪（如契达干酪）中，乳杆菌对干酪的成熟起着很重要的作用。干酪的其他变化，尤其是其成品的特征则取决于其他微生物（例如霉菌成熟干酪中的青霉菌和瑞士干酪中的丙酸杆菌）的生长和新陈代谢能力。
关于微生物造成的产品腐败和对人体健康危害等问题，要对两种类型的干酪分别讨论：软质干酪和鲜干酪的水分活度和pH很容易造成产品的腐败，只能放入冰箱保存；硬质干酪和半硬质干酪（如契达干酪、Provolone干酪和Edam干酪）的保质期都较长，在20℃的环境温度下仍能长期保存。但所有类型的干酪，包括硬质干酪，都可能引发沙门氏菌肠炎。导致这种疾病发生的原因通常是因为食用了未经巴氏杀菌的乳制成的干酪。另外，虽然沙门氏菌在低pH时会逐渐死亡，但大多数菌都能存活两个月以上。
软质干酪或半软质干酪常存在葡萄球菌毒素和大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌等肠道致病菌公共健康危害菌；硬质干酪的水分活度较低，能为乳清分离后压制阶段残存的致病菌提供长期的生存环境，甚至生存条件苛刻的致病菌（如流产布鲁氏杆菌）都能在硬质干酪中存活几个月。
干酪的质量评估应该包括对大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验。另外还应包括金黄色葡萄球菌和其他重要的致病菌的检验。所有类型的干酪都可能引起金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒，这些葡萄球菌可能来自携带该菌的人或患有乳腺炎的牛。金黄色葡萄球菌肠毒素的产生是由于部分发酵菌种失活产生了低酸环境造成的。金黄色葡萄球菌成熟后数目会降低，所以对任何细菌数超过100/g的样品都要考虑是否存在内毒素的危害性。但产品中不存在金黄色葡萄球菌并不意味着干酪就是安全的，细菌可能在产品成熟过程中死亡，但活性内毒素却可能已经存在于干酪中。
（一）取样
抽取用于细菌学检验的干酪样品时应该用无菌的取样工具，并将样品转移到无菌的样品罐中。根据所检验干酪类型的不同制定详细的取样技术。
样品的质量不小于50g。
小块软质干酪和小块袋装干酪，抽取完整的干酪或小袋的包装；其他不宜用取样器取样的软质干酪和半硬质干酪，可以用无菌的小刀从干酪的中心呈辐射状切两刀，使干酪样品呈楔形，并在移入样品缸前去掉所有不可食用的部分。
对于大块硬质干酪，使用无菌的干酪取样器非常方便。将取样器从干酪的一个平面距干酪边缘不小于10cm的地方向中心斜插进去，切掉外部2cm的表层干酪，然后切取干酪样品。
（二）稀释液的制备
可以使用25%Ringer氏溶液或2%的柠檬酸溶液作为稀释液，在45℃制备乳浊液，其中后者易使凝乳分散，释放微生物。手摇、使用浸渍器或Colworth均质器等能够加快乳化作用。若采用手摇方式，要先无菌磨碎或剁碎样品。
用0.1%的蛋白胨水对10-1的溶液进一步稀释。初始乳浊液的制备方法会影响计数的结果，所以每个实验都要认真选择适当的稀释方法。
（三）镜检
1.定性检查
用干净的载玻片在新切开的干酪的平面上用力压下，或用两个载玻片用力夹住切下的小块干酪，然后将玻片分开，移去玻片边缘多余的干酪，用二甲苯脱脂1min（在通风柜中）并在空气中晾干，革兰氏染色后镜检。记录玻片上微生物的种类及数量。应多观察几个视野，因为在成熟的干酪中，细菌经常以菌落的形式存在而不是均匀地散布于整个干酪中。
2.定量检测
将干酪样品稀释液制成涂片，用改良的Newman染色法染色后镜检，检测结果可以作为制备培养物稀释液的参考。
（四）一般菌株的检测
1.需氧嗜温菌计数
使用酵母葡萄糖肉汤琼脂（培养基82），30℃培养3d。这种非选择性培养基可以促进许多乳酸菌的生长，但当乳酸球菌的量较多时，乳酸杆菌不能生长。
2.乳酸杆菌
用MRS培养基可以很好地分离到乳酸杆菌，该培养基能促进乳酸杆菌的生长而抑制乳酸球菌的生长，一些明串珠菌和片球菌也能在此类培养基上生长。这种培养基在干酪成熟早期，乳酸球菌数量占明显优势时用于检测乳酸杆菌十分有用。30℃培养3～5d后可以从契达干酪和类似的干酪中分离到链球菌。
3.肠道菌和大肠菌群
参见第二章实验15.致病性大肠杆菌的检测，参见第二章实验18.
4.酵母菌和霉菌
参见第二章实验14.
5.金黄色葡萄球菌
参见第二章实验21.
6.产气荚膜梭状芽孢杆菌
用MPN法计数。
7.单核细胞增生李斯特氏菌
参见第二章实验25.
（五）乳酸杆菌纯菌株的分离和保存
1.菌种分离
参见第二章实验35.
2.菌种保藏
参见第二章实验33.
（六）瑞士干酪中丙酸杆菌的分离
用酵母浸膏乳酸盐肉汤（培养基62）可从瑞士干酪中分离到乳酸菌。这种培养基之所以称之为选择培养基，是因为它能提供满足丙酸菌生长而抑制其他菌生长的最小的营养成分，需要时可以用它做丙酸杆菌的计数。在培养基中加入琼脂就可制成半固体培养基。培养基中的乳酸发酵可以产生二氧化碳，所以，若培养后培养基产生分裂，则可怀疑有丙酸菌存在。如可能应在厌氧状态下分离丙酸菌。其操作步骤如下：
（1）制备稀释液，在45℃接种熔化的酵母膏乙酸半固体琼脂，在手中转动试管充分混匀，直至冷却，表面用冷却至45℃的2%琼脂封住，30℃培养。最好在5%的二氧化碳厌氧的环境中培养7～10d。
（2）试管的培养基表面若出现气体裂缝则认为有可疑的丙酸菌，用显微镜观察并进一步转接培养验证。丙酸菌为小的革兰氏阳性球杆菌，无运动性。通过这些特征能很容易地将它与培养基中的大肠菌群和梭状芽孢杆菌区分开。记录产生裂缝的最高稀释度，得出每克干酪中丙酸菌的估计值。
（3）从一个可疑的阳性管中取一环菌划线于酵母膏乙酸琼脂，30℃培养5～7d后，再用5%的二氧化碳厌氧培养或将层状平板置于富含二氧化碳的环境中需氧培养，最好采用厌氧培养法。
（4）选择单个菌落，革兰氏染色后观察，将可疑菌落转接到酵母浸膏乳酸盐肉汤（培养基62）或酵母葡萄糖肉汤（培养基82）中，30℃培养，需要时应再次划线分离。
（5）分离的纯菌株穿刺接种到酵母葡萄糖肉汤琼脂中，培养到有菌长出，然后表面用灭菌的液体石蜡覆盖。
（七）成熟干酪中霉菌的分离
霉菌成熟干酪中的半硬质干酪一般用娄地青霉（Penicilliumroqueforti）作为成熟菌，该菌在干酪的内部生长。而较小的或较薄的软干酪成熟菌一般为沙门柏干酪青霉（Penicilliumcamemberti）或常用的干酪青霉（Penicillium caseicolum）、白青霉（Penicilliumcandidum），这些菌一般生长在干酪的表面。将干酪碎片放到适于霉菌生长的选择性培养基上，可以从霉菌发酵干酪中分离特定的霉菌纯菌株。其操作步骤如下：
（1）用接种环移取一块干酪中生长的霉菌块，加入盛有2mL25%的灭菌的Ringer氏溶液中。
（2）用稀释技术获得单个的菌落：取一满环制备好的悬液，在45℃接种于10mL孟加拉红培养基（培养基31）、熔化的PDA培养基（pH3.5）（培养基27）或察氏培养基（pH3.5）（培养基22）中。在手中转动混匀后，取一环琼脂混合物转接到第二管熔化的培养基中，然后将第一管培养基倒入平板，同样混匀第二管的培养基，接种一环到第三管之后，再倒入平板。重复上述操作，共制备4个平板，在25℃培养3～5d。
（3）检查平板上分离的菌落是否为所需的霉菌菌株，详细记录菌落的外观。分离菌种的鉴定可通过镜检的方法进行。
（4）用直的接种针将分离的菌株转接到PDA斜面上，25℃培养3～5d。分离的纯菌株可以在该培养基上保存，每隔3～6个月转接一次。
（5）菌株蛋白分解活性检测：将菌株接种到10%的牛乳琼脂平板上，25℃培养14d以上，若菌落周围出现清晰带则证实有蛋白的分解作用。
（6）菌株的脂肪分解活性：将菌株接种到三丁酸甘油酯琼脂（培养基49），25℃培养不小于14d。
（八）细菌促熟的软质干酪中扩展短杆菌的分离
扩展短杆菌能促进软质干酪的成熟，它能在软干酪表面层生长。菌落呈橘黄色或褐色，呈现出酪样特征。另外生长在林堡等典型的细菌促熟软质干酪上的扩展短杆菌（Brevibacterium linens）也可在霉菌促熟的软质干酪表面形成橘黄色或黄褐色的斑点。其操作步骤如下：
（1）在干酪表层取样，加入2mL，25%Ringer氏液制备混悬液，划线接种到含5%氯化钠的营养琼脂表面，也可以用干酪琼脂，它能增强扩展短杆菌产生橘黄色色素的能力，25℃培养5d。
（2）革兰氏染色观察产生橘黄色色素菌落的细菌形态。将分离到的可疑扩展短杆菌接种到营养肉汤中，在25℃培养，并再次划线于营养琼脂上。对分离到的纯菌株进行鉴定。
（3）纯菌株保存在营养琼脂斜面上，每隔3～6个月转接1次。
（九）检测结果和微生物学规定
我国的干酪标准对微生物指标的要求。
八、奶油
奶油是由巴氏杀菌的稀奶油制成的，它很少引起食物中毒和疾病的传播。
奶油的卫生质量的评估包括4.5℃和30℃时需氧嗜温菌计数、霉菌和酵母菌计数、脂肪分解菌计数、大肠菌计数和耐盐菌计数。需要时可以进行金黄色葡萄球菌计数或用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素。
用未成熟的奶油可加工甜奶油，而用柠檬酸发酵菌发酵的奶油可做成熟奶油。许多在奶油中的菌在加工或生产过程中转移到了酪乳中，有些菌在成品奶油中仍能存活。奶油中可以加盐或不加盐，盐的含量为0.5%～2.5%。官方通常会规定奶油中的水分含量，英国规定奶油中水分不大于16%。盐在液相中的有效含量比在全部奶油中的含量大得多，2%的盐在16%水分中的相对含量是12.5%，这个含量能抑制很多微生物的生长。当水滴很小且分布在整个奶油中时，就能更好地抑制微生物的生长。另外低温储存也能防止奶油中微生物的生长。但低温下生长的微生物也会引起奶油的腐败，尤其是那些分解蛋白、脂肪，使风味丧失或引起脱色的微生物更容易引起产品的腐败。
（一）取样
用于细菌学检测的奶油样品在取样时需要使用无菌工具，并无菌操作转移到灭菌的容器中。奶油不能接触纸或其他能吸水的表面。取样时，先去掉取样区域表面5mm厚的奶油，然后用无菌的取样器移去距表层25mm厚的样品（或作为表面样品的一部分）。最少应取50g样品。
产品包装时很容易造成表面的污染，所以要对产品表面和中心同时取样。当需要对表面样品单独检测时，用无菌的刀或铲按要求的深度取表面样品，转移到无菌样品罐中。
样品在送往实验室的过程中要保持冷藏并应尽快检测。
检测的量以体积或质量为单位，振荡使样品溶化，样品包括水相和脂相两部分。很多菌存在于水相部分，所以可对水相部分单独检测（尽管这时较难计算每克产品中的菌体数）。
（二）菌种检测操作步骤
在45℃水浴中将样品在样品瓶中快速溶解（温度不应超过45℃），在30cm的幅度内以50次/min的频率振荡溶解样品。
当以容量为单位（体积比）分析时，取10mL溶解的样品到含90mL稀释液的200mL容量瓶中。稀释液为含有0.1%的蛋白胨和0.1%的琼脂溶液，它能使悬液稳定。移液管和溶液在操作时均应保持45℃；以质量为单位分析时，用天平称量10g样品加入90mL溶液中，在30cm幅度内摇动奶油溶液25次，制成10-1的均一悬浮液。
依次制备10倍稀释溶液至10-4或按要求稀释，然后进行以下操作：
（1）用平板计数琼脂进行需氧嗜温和嗜冷菌计数 分别于30℃和4.5℃培养3d和14d。
（2）酵母菌和霉菌计数 参见第二章实验14.
（3）用30%的牛乳琼脂（培养基44）进行裂解计数（caseolyfic counts）在30℃培养5d。在菌落计数前用蛋白沉淀剂覆盖平板，裂解菌落周围会出现一清晰的圈带，以此可进行菌体的验证。
（4）脂肪分解测试培养基 很多培养基可用于此实验。三丁酸甘油琼脂是一种简单的培养基，但生长于这种培养基上的大部分微生物不能水解较复杂的脂肪（如黄油或人造奶油），所以最好使用复杂的脂类的培养基或不加丁酸甘油酯的琼脂；也可以先用一个培养基分离菌株，然后在其他培养基上检测脂肪的分解能力；另外还可以使用单个传代菌株的分离技术或快速的复制技术，在22℃培养5d或30℃培养3d。
（5）肠道菌和大肠菌群检测 参见第二章实验15，30℃培养24h。
（6）嗜盐/耐盐菌计数 用15%氯化钠制备系列稀释液和15%的氯化钠培养基。
（三）结果和推荐标准
按所用的分析方法的要求，记录每毫升或每克奶油的测试结果。
未成熟奶油生产的奶油中需氧嗜温菌数应小于10000个/g，蛋白分解菌、脂肪分解菌和嗜热菌均应小于1000个/g，霉菌和酵母菌小于100个/g，大肠菌群小于10个/g。我国的奶油标准对微生物指标的要求。
（四）脂肪分解微生物的分离和进一步研究
选择分解脂肪的微生物菌株，革兰氏法染色后镜检涂片，并将其转接到半固体的酵母葡萄糖肉汁琼脂中，22℃或30℃培养到长出菌落，然后重新检测并在固体培养基上划线，分离纯菌株。
将分离到的菌株分别划线接种到系列测试培养基表面，检测其脂肪分解的活性（如吐温琼脂）。不进行计数的菌可以在同一个平板或培养基上进行检测。
要确定分离菌株的耐盐性，可以用上述半固体营养琼脂培养物制备24h脂肪分解菌营养肉汤培养物。分别取一标准接种环肉汤培养物转接到系列氯化钠营养肉汤中（如分别含5%，10%，15%和20%的氯化钠），也可以接种到营养肉汤中（0.5%氯化钠），22℃或30℃培养3～5d，记录每个试管中的生长情况，“嗜盐”计数分离的耐盐菌也可以用相同的方法检测。
九、冰淇淋和冷冻甜点
这类产品的微生物检测包括细菌总数、肠道菌（或至少要进行大肠菌群计数）、金黄色葡萄球菌计数和沙门氏菌检测等，英国现行标准为特定的微生物计数。食品加工厂生产的冰淇淋和冻甜点在加工之后和食用之前要在硬化室存放一段时间，利用这段时间进行微生物检测，并在24～48h给出检测结果。
（一）取样
1.硬质冰淇淋样品
由一个或多个未开包的包装袋组成，将其放在无菌容器中完整地送到实验室。对多层冰淇淋，取样时每层的取样比例应一致；大容器中的冰淇淋，首先用无菌刮匙移去上层，再用另一只无菌刮匙取不小于60g的样品，放在无菌罐中；对市售的大容器冰淇淋，用零售商特制的冰淇淋食用工具移取表面样品。
2.软质冰淇淋
新鲜的冰淇淋直接在冷藏状态下出售，因此可直接从冷藏机的出口取样，样品量不得小于60g。
3.样品的运输
样品应置于冷藏容器中送至实验室，测试前温度均应保持在-18℃以下。最好是在取样后2h内使用隔离容器将样品送到实验室。样品要装在带冰容器内，至少在6h内送到实验室。
（二）样品处理
1.零售包装的样品
在无菌条件下取完整样品或代表性的样品至无菌容器内。样品量应不小于60mL。
2.冷冻样品
需在室温下1h内解冻，或在42～45℃水浴中15min解冻。
3.非冷冻样品
可直接检测。
（三）菌株检测
应采用质量作为分析单位，因为10mL冰淇淋样品的质量范围可能为4.5～10.5g。
检测步骤为：翻转取样瓶3次使样品充分混匀，用一支10mL无菌移液管，移取10g融化的冰淇淋至一个无菌容器中。加入90mL菌稀释液，充分混匀，作为10-1稀释液，根据测定需要，使用相同方法稀释至10-4或按要求进行稀释，接着进行如下测定：
（1）用平板计数琼脂和酵母膏牛乳琼脂倒平板，在4.5℃和30℃下分别放置14d和3d测定嗜冷菌和嗜温菌。
（2）用紫红葡萄糖琼脂或紫红乳糖酶琼脂倒平板，30℃下培养24h，分别测定肠道菌和大肠菌群。含量较少的样品可采用MPN法测定。
（3）霉菌和酵母菌参见第二章实验14.
（4）金黄色葡萄球菌检测参见第二章实验21.
（5）参照实验室巴氏消毒牛乳的检测方法，进行嗜热菌计数。
（6）沙门氏菌测定参见第二章实验18.
（7）李斯特氏菌测定参见第二章实验25.
（四）结果和标准
理论上经巴氏消毒后的冰淇淋样品应不存在肠道细菌。ICMSF（1986）对需氧嗜温菌计数和大肠菌群计数所推荐的规定十分宽松。
需要注意的是需氧嗜温菌和大肠菌群的计数不是强制性的。但是一些经营有方且规模较大的冰淇淋生产企业的产品质量要优于上述规范，通常能达到30℃下需氧嗜温菌数低于1000个/g，大肠菌群低于1个/g。
另外还有一个严重的问题是冰淇淋在零售时混放在一起。在流动车上装载的软冰淇淋，放在分发车上部表面的冰淇淋会造成微生物的污染。混合放置造成的污染，保存温度不合适造成的污染，设备未进行严格清洁和灭菌都会使需氧嗜温菌数超过10个/g。
第三个类型的产品是合成冰淇淋和冻牛乳甜点，牛乳热处理后加入了其他原料，如饼干、水果、花边奶油等外部装饰时，很容易带入部分微生物造成食品污染。实际上这些添加物尤其是碎果仁会带入大量的微生物。因此，对这些添加物的微生物监控十分重要。
综合训练
结合你实习的工厂，检测其主要产品的微生物指标，并完成检测报告。
