实验目的
（1）学会乳酸菌的菌种保藏与活化方法。
（2）掌握乳品发酵剂一般制作程序及其品质鉴定方法。
实验原理
乳品发酵剂是用于乳发酵的微生物纯培养物。发酵剂最初应用的菌种称为原培养物。原培养物的菌数远不够发酵原料乳所需要的量，需将其扩大培养成为母发酵剂，再扩培至生产发酵剂或工作发酵剂，才可用于原料乳的发酵。发酵剂仅用一株发酵乳糖能力强的乳酸菌制备，称为单一菌种发酵剂；而采用两种或两种以上的乳酸菌制作，称为复合菌种发酵剂。
牛乳经发酵可产生令人满意的芳香味或使产品质地发生改变而提高适口性。乳品发酵剂是制作酸乳、干酪、乳酒和酸奶油等发酵产品的关键步骤，其品质优劣直接影响产品的感官质量与风味适口性。例如，在制作普通酸乳发酵剂过程中，常出现污染杂菌、乳凝固不结实、乳清析出过多并出现鼓盖和异常味的现象；或者不注重培养过程中德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌在数量上的1：1比例，导致发酵时间延长，出现产酸不足、乳凝固性差、缺乏诱人的芳香味、口感差等现象。因此在实际生产中必须掌握发酵剂的调制、保存以及乳酸菌种的保藏与活化技术。本实验以普通酸乳发酵剂为例，介绍其一般制作程序和方法，指出制备过程中应注意的问题，以及发酵剂品质的鉴定方法。
实验材料
（一）菌种
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp。bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）脱脂乳试管培养物。
（二）培养基
脱脂乳培养基（培养基18）（5mL或10mL/试管，100mL/三角瓶，0.07MPa灭菌20min）。
（三）试剂与染色剂
无菌生理盐水或无菌水、革兰氏染色液。
（四）仪器与其他用品
特制蜗卷铂耳环、接种环、镊子、75%酒精消毒棉球、载玻片、酒精灯、显微镜、高压灭菌锅、冰箱、温箱、无菌超净工作台、无菌试管、无菌吸管（1mL或2mL）等。
实验流程
待保藏菌种→适温培养→菌种保藏→菌种活化→发酵剂制备→品质鉴定
实验步骤
（一）乳酸菌的菌种保藏
在制作酸牛乳、干酪、酸乳油和微生态制剂时，需用不同的乳酸菌预先制备各种发酵剂，而所用的乳酸菌常以菌种形式保藏。目前常用的保藏方法有脱脂乳试管法和低温冷冻真空干燥法。
1.脱脂乳试管保藏法
以无菌操作用灭菌蜗卷铂耳环取1～2环（尽量自试管底部取菌）脱脂乳试管原菌种移植于新鲜5mL脱脂乳试管中，轻轻振荡后，于37℃温箱中培养过夜，待乳凝固时取出。观察其凝固性状，应该乳凝固结实、致密，允许有极少量乳清析出或最好不析出。同时进行涂片、革兰氏染色镜检，确定无杂菌污染，尤其是无酵母菌和芽孢杆菌污染，而后置于4℃冰箱中保存。每隔2～3周同法传代一次，以维持菌种活力。
2.冷冻真空干燥保藏法
于安瓿菌种管内经冻干的乳酸菌，置4℃冰箱中一般可存活5～15年，亦便于携带。
（二）乳酸菌的菌种选择与活化
1.乳酸菌的菌种选择
在发酵乳制品生产中常用的乳酸菌有十几种，应用时要根据发酵产品的种类进行有目的的选择。乳品发酵剂常用乳酸菌的种类与菌种特性。
2.乳酸菌的菌种活化
保藏菌种的活力均不旺盛，处于维持生命的休眠状态。特别是冻干菌种在冻干过程中受到激烈的物理刺激，大部分已死亡，仅有百分之几的存活率。因而菌种在生产使用之前要进行活化，使其活力恢复正常，具体操作如下。
（1）冻干菌种的活化 在无菌超净工作台内，先用75%酒精棉球擦拭消毒安瓿瓶（管）外壁，而后将安瓿管上部用酒精灯火焰烧热，再滴几滴无菌水或生理盐水于加热部分，使玻璃管炸裂后，用灭菌镊子轻掰掉管的上部，以灭菌铂耳环捣碎干燥物，烧烤管口待冷却后，将少量或全部粉末状菌种转入灭菌脱脂乳试管1～2支中，摇匀后，置于37℃温箱中培养至凝固，再移植到新的灭菌脱脂乳试管中培养，传代活化几次，直至活力恢复为止。一般酸乳菌种37℃过夜培养乳即凝固，表明其活力已恢复，即可投产使用。
（2）脱脂乳试管保藏菌种的活化 直接用灭菌蜗卷铂耳环取1～2环原培养物，接入灭菌新鲜脱脂乳试管中培养即可。其活化方法与脱脂乳试管保藏方法相同，可循环使用。
实验注意事项：
①全部活化过程要求严格无菌操作，否则污染杂菌给实验或生产造成麻烦或损失。应该在无菌超净工作台内酒精灯火焰旁进行无菌操作。
②注意培养活化时间勿过长，培养至乳凝固即可。否则因产生乳酸过高，而导致乳清析出过多，菌种容易衰老，其活力反而下降。一般活力高的菌种经37℃培养过夜牛乳即凝固，此时不需继续传代活化，可将菌种管放入冰箱中保藏或制作发酵剂使用。如果凝固时间超过12h，说明菌种活力尚未恢复，需每日传代移植一次，反复传代几次至菌种活力恢复为止。
③活化冻干菌种时，脱脂乳添加0.5%葡萄糖与0.5%酵母膏可以加快活化速度。
④注意在每次活化之后，均要进行革兰氏染色镜检，如果菌种纯一，无杂菌污染，且发酵活力已恢复，方可作为发酵剂菌种；如果菌种不纯，则必须做分离培养，分纯菌种后，才可继续活化使用。
（三）发酵剂制作方法
1.单一菌种母发酵剂的制备
将冻干菌种或脱脂乳试管保藏菌种活化2～3次，37℃培养过夜至乳凝固良好且无杂菌污染。无菌吸取Lb和St试管培养物1mL转接入盛100mL脱脂乳的三角瓶中（按制备母发酵剂所用脱脂乳量的1%接种），充分混匀后，置于37℃温箱中培养过夜或于43℃培养3～5h，待乳凝固结实后，供制备生产发酵剂使用。
2.单一菌种生产发酵剂的制备
将母发酵剂经过染色镜检为纯一的培养物后，按生产发酵剂所用原料乳量的1%～2%取母发酵剂，接种于盛有5L灭菌原料乳的大三角瓶中，充分混匀后，置于37℃温箱中培养过夜至乳凝固后，冰箱中保藏备用。
实验注意事项：
（1）应选择新鲜、品质好的牛乳制作脱脂乳培养基。鲜乳中菌数不能太高，一般低于104个/mL，不含抗生素和消毒剂，不宜选用乳房炎乳制作发酵剂。脱脂乳培养基灭菌要确实，一般0.07MPa灭菌20min。灭菌结束后，应尽快人工放气降压，将培养基立即取出，否则牛乳受热时间过长发生褐变（美拉德反应），破坏牛乳营养成分而影响乳酸菌生长。
（2）如果采用德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌制作普通酸乳时，为保证球、杆菌数量在发酵过程中维持适宜的比例，最好先分别制备单一菌种发酵剂。使用时再分别以1.5%接种到原料乳中，总接种量为3%，发酵温度43℃培养2.0～2.5h，或37℃培养3.0～3.5h。因为混合菌种经几次扩大培养后，两种菌在数量上的1：1比例容易失调，导致产酸慢，延长发酵周期。对复合菌种的发酵剂亦要注意各菌之间的菌数比例平衡问题。
（3）如果采用嗜酸乳杆菌与乳酸乳球菌乳脂亚种生产保健酸乳时，为保证球、杆菌数量在发酵过程中维持2：1比例，宜分别制备单一菌种发酵剂，方法同上。使用时再分别以2%和4%接种到原料乳中，总接种量为6%，发酵温度41℃培养3.0～3.5h，或37℃培养5～7h。
（4）盛装发酵剂的容器最好用玻璃制品，以便观察牛乳发酵情况。容器应严密，口要小，盖或塞要紧密，以防微生物污染。三角瓶口小，容量大，用棉塞塞紧瓶口较严密，适于制备发酵剂。当然也可采用金属容器。
（5）接种时要严格按无菌操作进行，防止杂菌污染。最好在无菌室内调制发酵剂，可减少空气污染，特别要注意酵母菌、霉菌与噬菌体的污染。操作台要用消毒水消毒。接种时尽量不要直接倾倒，而用灭菌吸管转移。
（6）发酵剂培养凝固后应立即冷却。发酵剂量少时可置于4℃冰箱中保存。量多时可在冷水中保存，直至使用。发酵剂在保存过程中不要振荡，否则破坏凝乳性状，不利于品质鉴定。
（7）母发酵剂仅第一次由原培养物（菌种）制作外，在一般生产过程中，均由前代发酵剂制作。如果出现污染或活力降低时才可使用试管菌种制备母发酵剂。
（四）发酵剂品质鉴定
1.感官检查
观察发酵剂的质地，组织状态，凝固性状与乳清析出情况，口味与色泽。品质优良的发酵剂应乳凝固结实，质地均匀细腻，组织状态致密、无块状物。用手轻击容器壁时，凝乳仍保持原状，有一定弹性。具有诱人的芳香酸味，如有苦味或其他异味、气泡和色泽变化，主要因污染杂菌之故。无乳清析出或析出较少。乳清析出多的原因：乳中干物质含量较低（低于11.5%）；培养时间超过了乳刚好凝固的时间，或培养温度超过菌种适宜生长温度，使产酸急剧增加，乳清大量析出；有杂菌污染，产生大量其他酸类物质等。
2.化学检查
主要检查酸度和挥发酸，含生香菌的发酵剂需检查丁二酮。
丁二酮检查方法：取发酵剂5～10mL置于试管中，加入等体积0.4g/mL KOH溶液和微量肌酐或肌氨酸，振荡混匀，静置于48～50℃水浴中2h（或37℃温箱中4h），观察结果。如有丁二酮存在，试管的上部呈现红色。
3.细菌学检查
主要检查发酵剂内的乳酸菌数量及有无杂菌污染情况。品质好的发酵剂菌数不应低于108～109个/mL。乳酸菌计数方法有两种：
（1）显微镜直接计数 将发酵剂经1：10稀释后，取5μL涂片、固定、甲苯胺蓝染色、镜检菌数，同时观察有无杂菌污染。
（2）平板菌落计数法 利用MRS乳酸菌计数培养基，采用稀释倾注平板培养法检查发酵剂的活菌数。
前一种计数方法快速简便，但误差较大，死活菌都计数在内。后者计算活菌数，采用改良MRS培养基可以选择性地快速检测乳酸菌的数量。
4.活力测定
以凝乳时间、产酸能力、还原刃天青能力、活菌数量判定发酵剂菌种的活力。
（1）肉眼观察 观察并记录单一菌种发酵剂的凝乳时间。
（2）酸度测定 用0.1mol/L NaOH滴定法测定发酵剂的酸度。
（3）还原刃天青能力 测定还原刃天青所需的时间。
（4）活菌计数 采用稀释倾注平板培养法测定发酵剂的活菌数量。
实验结果与报告
鉴定你所做的普通酸乳发酵剂的品质，并分析乳清析出较多的原因。
思考题
（1）如何进行乳酸菌的菌种保藏与活化？
（2）制作乳品发酵剂应注意哪些问题？
