实验目的
了解肠球菌检测的原理，并掌握其操作方法。
实验原理
肠球菌是环境、食品和临床微生物学上重要的乳酸菌。它们是人类和动物消化道中的主要常驻菌。动物屠宰时，消化道中的肠球菌会污染到肉中。在欧洲，肠球菌被用来生产发酵食品，如香肠和干酪，其中肠球菌或者是以发酵剂的形式直接添加到食品中，或者就是自然污染的。因为肠球菌是消化道常驻菌，并具有良好的功能和工艺特性，所以其中的一些菌株已经被成功地作为益生菌使用。肠球菌有害的方面主要是与食品腐败有关，特别是肉制品的腐败，更重要的是有一些菌株还具有致病性，它们是典型的条件致病菌。在过去的20年，肠球菌是重要的医学病原菌，由它们引起的疾病例数的增加主要因为其对抗生素抗性不断提高。肠球菌的“两面性”使其一方面可作为食品发酵剂或益生菌，而另一方面我们又要关注其抗生素抗性、致病性以及在人类疾病中的作用。
肠球菌通常作为监测纯净饮用水和某类型食品中污染粪便的指示菌。依据有些工作者的报道，肠球菌在水中比大肠菌和其他肠杆菌存活期长，在水受到粪便间歇性地污染时，它们成为很有用的指示菌。在肉和肉制品中常污染有肠球菌。粪肠球菌是牛肉、猪肉切口上的优势肠球菌，而屎肠球菌和肠道肠球菌更经常地分离自加工的肉制品。由于肠球菌能抵抗不利的环境条件，使它们成为某些干燥和冷冻食品处于不卫生条件的指示剂。例如，有时冷冻蔬菜可能含有肠球菌高达1000以上形成菌落单位（CFU/g），而干燥蔬菜含有的肠球菌少于100CFU/g。
肠球菌是化能异养菌，其复杂的营养要求通常使用含蛋白胨和其类似物的培养基可满足需要，它们也可培养于脑心浸液和其他丰富营养培养基。有60种以上的选择性培养基已报道可用于肠球菌的分离和培养，但这些培养基大多数也能使某些链球菌生长。通常应用的使肠球菌生长的培养基同样也能让牛链球菌（S。bovis）生长。这点需引起注意，避免混淆。叠氮化钠是最为广泛应用的选择剂。虽然也有应用其他选择剂的，例如胆汁、乙酸铊、乙基紫、结晶紫、亚碲酸盐、硫氰酸钾、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、卡那霉素、多黏菌素和黏杆菌素等，但经使用，这些试剂的选择性均不及叠氮化钠。大多数培养基含有2～5g/L叠氮化钠。由于肠球菌一般抗20μg/mL氨基糖苷抗生素卡那霉素，因此可将此平均数量的抗生素结合叠氮化钠作分离用。卡那霉素七叶灵培养液及琼脂即为这类培养基。如KF培养液和琼脂培养基中含有0.4～0.5g/L叠氮化钠，在某种程度上可抑制牛链球菌（S。bovis），而肠球菌可在其上良好生长，但盲肠肠球菌（E。cecorum）即使叠氮化钠在如此低浓度也将受到抑制。
实验材料
（一）材料
乳品厂加工用自来水或深井水（无菌取样）。
（二）培养基
TTC叠氮化钠琼脂（培养基105）。
（三）试剂
灭菌生理盐水（9mL/管，225mL/250mL三角瓶）。
（四）仪器及其他用品
45℃水浴箱、恒温培养箱、无菌平皿、无菌吸管、灭菌涂布棒等。
实验流程
制备TTC叠氮化钠琼脂→做成3个适当倍数的稀释液→各稀释度分别以1mL加入灭菌平皿中→涂布均匀→恒温培养（37℃，48h）→菌落计数→报告
实验步骤
（1）将冷却至45℃左右的TTC叠氮化钠琼脂注入平皿中，凝固备用。
（2）在无菌操作条件下，在一个灭菌平皿内倾入15mL营养琼脂培养基，并暴露至接种过程结束，标记后作为环境对照品。
（3）以无菌操作吸取1mL注入含有9mL无菌生理盐水试管中，即为1：10稀释液。
（4）用无菌吸管吸取1：10稀释液1mL注入含有9mL无菌生理盐水试管中，即为1：100稀释液。依此类推，还可制成稀释倍数为1：1000的稀释液。做一次递减稀释液换一次吸管。
（5）用无菌吸管分别吸取1mL原水样、1：10、1：100稀释液于TTC叠氮化钠琼脂平板中，每个稀释度作3～4个平皿，每个稀释度分别采用不同的灭菌涂布棒涂匀。
（6）按以上步骤，以1mL无菌生理盐水作为空白操作对照。
（7）将所有平皿（包括空白和环境对照）翻转，即保持有标记和培养基的一面朝上，置于37℃温度下培养48h，菌落计数。
在TTC叠氮化钠琼脂平板上肠球菌的菌落为红色，米粒大小（直径最大为2mm），有光泽，边缘整齐。
注意：叠氮化钠有剧毒！使用时应格外小心。
实验结果与报告
计数方法：选择稀释度合适的平板查菌落数，取平均值后再乘以稀释倍数即为每1mL样品中所含的肠球菌数。
报告方式为：每1mL（g）样品所长出的菌落数即为样品中所含的肠球菌数。其单位是CFU/mL（g）。
思考题
检测培养基中加入氯化三苯基四唑和叠氮化钠的目的是什么？如果用普通营养琼脂估计会出现什么结果？
