一、生产菌种的分离与筛选
（一）采样
根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合分析决定采样地点。
由于土壤是微生物的发源地和大本营，尤其细菌和放线菌在土壤中存在的更多，就是水和空气中的微生物多数也是从土壤中散发出去的，所以如果我们不知道生产某种产品的微生物种类或某些特性时，一般可以土壤为样品进行分离。1g土壤中含有微生物几百万至几十亿个，而且微生物种类也随土质有所不同。
一般有机质较多的土壤，微生物的数量也多。在园田土和耕作过的土中，以细菌和放线菌为主；在有很多动、植物残骸的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌就较多。
采土的深度，一般离表层5～15cm处较适宜，因为此深处的土含微生物最多。采土的最适季节，在北方，应属春秋两季，因为此时的温度、湿度对微生物的生长繁殖最合适，土壤中的微生物数量最多。一般应避免雨季采土，因此，在大部分南方地区，以秋季采土比较理想。除此之外，土壤的酸碱度也应注意，细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多，而酵母菌和霉菌，由于它们对碳水化合物的需要量较多，一般在偏酸性的土壤、普通植物花朵、瓜果种子及腐植物等上面较多。
采样的方法，是在选好适当地点或场所后用无菌器具按照规范取样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点环境情况等，以备考证。一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌的孢子忍耐不良环境的能力较强，因此不太容易死亡。但是由于采样后的环境条件与天然条件有着不同程度的差异，微生物必然逐渐减少，种类也会起变化，所以应尽快分离。
（二）增殖培养
在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养，其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。
（三）纯化
增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因素，但其他微生物并没有死去，只是数量相对减少，一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。故增殖培养所得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为两个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法、涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；涂布分离法与划线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在固体培养基表面均匀涂布；稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的几率较大，该法是将降至40左右的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种方法的具体操作很多，最简便的是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离，也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取；如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘稀疏的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。
为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。
（四）性能鉴定
菌种性能鉴定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。
直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。所以，常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。
二、工业生产菌的育种
尽管生产菌种最初均来自于自然界，但天然菌种的生产性能一般比较低下。20世纪40年代抗生素工业的兴起，推动了微生物遗传学的快速发展，也为微生物发酵工业优良菌种的人工选育奠定了理论基础。优良菌种的选育为生产提供了各种类型的突变株，大幅度提高了菌种产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展，使菌种选育技术不断更新，而研制出众多有价值的微生物工程产品。
自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术等都被用于优良生产菌种的选育。
（一）自然选育
不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育（spontaneousmutation）。这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量的诱变效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构会引起碱基的错配。例如胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。平衡是倾向于酮式或氨基式的，因此DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。但偶然的情况，当T以烯醇式出现时的一瞬间，DNA链正好合成到这一位置上，与T配对的就不是A，而是C；若C以亚氨基式出现时的一瞬间，DNA链正好合成到这一位置上，与C配对的就不是G，而是A。在DNA复制过程中发生的这种错误配对，就有可能引起自然突变。这种互变异构现象是无法预测的，对这种偶然事件作了大量的统计分析后，仍能找出规律来。据统计，这种碱基对错误配对引起自然突变的几率为10-8～10-9.
自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的菌株，选出优良的菌种。
在工业生产上，由于各种条件因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平的波动。所以技术人员要注意从生产水平高的批次中，分离生产能力高的菌种再用于生产。
经诱变或杂交选育获得的突变株，往往会继续发生变异，导致不同生产能力菌株的比例改变，这种情况下，自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。
自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。但是自然选育的效率低，因此经常与诱变选育交替使用，以提高育种效率。
自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。
（二）诱变育种
微生物在长期的进化过程中，形成了一套严密的代谢调控机制，所有的代谢产物都不会过量积累。因此为了提高菌种生产能力，满足生产的实际需要，必须有效地改变菌种代谢机制，促进菌体有用代谢产物的分泌与积累。诱变育种（mutation breeding）就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高。然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。
当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，故仍是目前被广泛使用的主要育种方法之一。
1.诱变育种的原理
诱变育种的理论基础是基因突变。突变主要包括染色体畸变和点突变两大类。染色体畸变指的是染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等，点突变指的是DNA中的碱基发生变化。诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。常用的诱变剂包括物理、化学和生物的三大类。
（1）物理诱变剂 物理诱变剂种类很多，主要有紫外线、X射线、γ射线、激光、快中子和超声波等。在微生物诱变育种中使用最多的是紫外线和射线辐射。
生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处，该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应。交联是由二聚体引起的。二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以在两条链的碱基之间形成，它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水化物。已经了解得较清楚的是胸腺嘧啶二聚体。
过量的紫外线辐射会造成菌体丢失打断的DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。紫外线对生物的效应具积累作用，也就是说，只要紫外线处理的总时间相等，分次处理与一次性处理的效果类似。
（2）化学诱变剂 化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多。根据化学诱变剂对DNA分子的作用方式，可分为与核酸碱基直接作用的诱变剂、碱基类似物和移码突变的诱变剂三种。
①与核酸碱基直接作用的诱变剂：主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。烷化剂（alklatingagent）带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基的称单功能烷化剂，带两个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其他分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。常见的烷化剂有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N'-硝基-N'-亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲（NMU）、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。甲基磺酸乙酯是单功能烷化剂，氮芥是双功能烷化剂。NTG和NMU因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。双功能烷化剂可引起DNA两条链交联，造成菌体死亡，所以其毒性比单功能烷化剂强。
碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤，并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。
烷基化的嘌呤碱与戊糖连接的N糖苷键很不稳定，若断裂后，核苷酸残基将脱去嘌呤碱基，DNA复制时任何碱基都能在此对应的位置插入，因此烷化剂既可能造成碱基转换，也可能造成碱基颠换。烷化剂造成的碱基置换同样都能由其回复，即A-T和G-C互变。此外，烷化剂使核苷酸残基脱嘌呤后，也可造成DNA缺失。由于烷化剂能与辐射一样引起基因突变和染色体畸变，所以也有拟辐射物质之称。
亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基，如使腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）分别脱氨基成为次黄嘌呤（H）、尿嘧啶（U）和黄嘌呤（X）。复制时，次黄嘌呤、鸟嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）配对。前两者能引起碱基转换，而第三种并没有发生转换。此外，亚硝酸也可能引起DNA双链交联。
羟胺（HA）能专一地与胞嘧啶作用。修饰后的N-4-羟基胞嘧啶只能与腺嘌呤配对，引起G-C和T-A碱基转换。羟基引起的转换是单向的，即无法引起T-A和C-G的碱基转换。羟胺是还原剂，在活细胞中，它与各种物质反应产生H2O2及一些非专一性的诱变剂，所以在体外它具较强的专一性，而在活细胞内丧失了专一性。
②碱基类似物：这些化合物有5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）和2-氨基嘌呤（2-AP）等。它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。
酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似，烯醇式5-BU结构与胞嘧啶相似。当把某一微生物在含5-BU的培养液中培养，DNA复制时，5-BU可取代T。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而与A配对。5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构，当DNA复制时，烯醇式5-BU不与A而与G配对，从而造成A-T和G-C的转换；当烯醇式5-BU在DNA复制时掺入DNA，并与G配对，若再从烯醇式转换成酮式，并与A配对，则会造成G-C和A-T转换。因为5-BU可使A-T转换成G-C，也可使G-C反向转换成A-T，所以，它引起的突变也可以由它本身回复。
2-AP是腺嘌呤的结构类似物，能与胸腺嘧啶配对，但当其质子化后，会与胞嘧啶错误配对。
碱基类似物引起的突变必须经过两代以上才能表现出来，因为引入新碱基的过程需经过三轮DNA复制。另外，它是通过DNA合成来达到诱变效应的，只对正在进行新陈代谢和繁殖的微生物起作用，对于休眠细胞、脱离菌体的DNA或噬菌体则没有作用。
③移码突变的诱变剂：移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部分后面的全部遗传密码产生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称为移码突变体。
吖啶类染料（原黄素、吖啶黄、吖啶橙及氨基吖啶等）和一系列称为ICR类的化合物（因由美国的肿瘤研究所“Institute for Cancer Research”合成而得名，它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物）都是移码突变的有效诱变剂。
吖啶类化合物的诱变机制并不是很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型的三环分子，与嘌呤-嘧啶碱基对的结构十分相似，故能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个吖啶类分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链中增添或缺失一个碱基，结果引起移码突变。
吖啶类化合物可以引起移码突变及其回复突变。在DNA链上增添或缺失一、二、四或五个碱基时，均会引起移码突变；而增添或缺失三或六个碱基时，则不影响读码，只引起较短的缺失或插入。
2.诱变育种的基本方法
诱变育种一般包括诱变和筛选两部分，诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。诱变育种是诱变和筛选的不断重复，直到获得高产菌株。
（1）出发菌株的选择 用来进行诱变的出发菌株的性能对提高诱变效果和效率十分重要。选择出发菌株应注意，诱变出发菌株要有一定的目标产物的生产能力，其他生产性能如生长繁殖快、营养要求低、产孢子多且早、对诱变剂敏感、变异幅度大等。还必须了解用做诱变的出发菌株的产量、形态、生理等方面的情况。可选择已经过诱变处理的菌株，因为这样的菌株对诱变剂的敏感性会有所提高。
（2）诱变剂的使用方法 在微生物诱变育种中，诱变的方法有单一诱变剂处理和复合诱变剂处理。复合诱变剂处理是指用两种以上的诱变剂处理菌种。对野生菌株单一诱变剂处理有时也能取得好的效果。但对经过多次诱变处理的老菌种，单一诱变因素重复处理，效果甚微，可以采用复合诱变剂处理来提高诱变效果。
复合诱变处理包括同一诱变剂多次处理，两种以上诱变剂先后分别处理和两种以上诱变剂同时或多次处理。例如，青霉菌的选育中先用不足以引起突变的氮芥短时处理，再用紫外线处理，可使诱变频率大大提高。其他如乙烯亚胺和紫外线，氯化锂和紫外线的复合处理，都是常用的方法，也有一定的效果。
（3）诱变剂的剂量选择 对不同的微生物使用的剂量不同，诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有一定的关系。因此可用致死率作为诱变剂剂量选择的依据。一般来说，诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度以后，再提高剂量反使诱变率下降。因此，近年来已将处理剂量从过去的致死率99%～99.9%降至70%～80%，甚至更低。但诱变剂剂量也不宜过低。高剂量诱变可导致一些细胞的细胞核发生变异，也可使另一些细胞的细胞核破坏，引起细胞死亡，形成较纯的变异菌落。并且高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤，促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。
（4）突变菌株的筛选 诱变处理后，菌种的形态或遗传性能有可能发生变化，如成为营养缺陷型突变株、抗性突变株、呼吸缺陷型突变株、温度敏感型突变株等等，但正向突变的菌株通常为少数，须进行大量的筛选才能获得高产菌株。通过初筛和复筛后，还要经过发酵条件的优化研究，确定最佳的发酵条件，才能使高产菌株的生产能力充分发挥出来。
3.突变株的筛选
（1）常用的初筛方法 在诱变育种工作中，筛选是最为艰难也是获得目的突变株最重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的突变细胞更少。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就必须设计出有效的筛选方法。
在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的任务是除去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不至于漏网，因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产性能。常用的初筛方法如下。
①菌体形态观察法：尽管众多突变菌株的菌体形态变化与产量并不一定存在相关性，但若能敏锐地捕捉、利用某些菌体的形态变异特征，将为初筛工作带来极大的方便。而有些菌体的形态变异却与产量存在一定相关性，如阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）的菌落形态变化对维生素B2产量有很大影响。高产菌的菌落色泽应为深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株；菌落直径8～10mm为宜，凡过大或过小者均为低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉（Penicillium urticae）的育种过程中也曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高；而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。因此，尽可能地利用所观察到的菌体形态变异，是提高初筛效率的有效方法。
②平皿快速检测法：平皿快速检测法包括纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。
A。纸片培养显色法：将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片放在培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。
B。变色圈法：将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或将指示剂溶液喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其培养后呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。
C。透明圈法：在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。若待筛选菌株的菌落周围形成透明圈，则透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。
在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。
D。生长圈法：利用一些对营养有特别要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
E。抑制圈法：待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。抑菌圈的大小反映了菌株对该物质的生产能力。一种较讲究的做法是将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其他因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4～5d，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其他地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2cm，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避免各菌落所产生抗生素的相互干扰。
这些方法较粗，一般只能在定性或半定量时用，但用于初筛可以大大提高筛选的效率。
（2）摇瓶培养法 在产量性状诱变育种中，为了花最少的时间和最小的工作量，将极少数的产量提高较为显著的正向突变个体筛选出来，就需要设计和采用效率较高的筛选方案和适宜的筛选方法。
筛选过程分为初筛和复筛。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精度）为主。例如，在工作量限度为200只摇瓶的具体条件下，为了取得最高工作效率，可设计以下筛选方案：
通过上述连续多轮反复筛选，直到获得满意的结果为止。采用本试验方案，不仅能以较少的工作量取得良好的效果，而且还可以使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不至于落选。
（3）营养缺陷型突变株的筛选 通过诱变育种，出发菌株发生基因突变，致使细胞组成成分的合成途径出现某些缺陷，例如氨基酸、核酸碱基或维生素的合成途径某一步被钝化或丧失，在只含有最低限度营养物质的基本培养基上不能生长，必须在此种培养基中加入某些有机营养物质才能正常生长的一类菌株叫做营养缺陷型菌株。突变前的菌株称野生型或原养型菌株。能满足原养型菌株的最低营养成分的培养基叫做基本培养基（MM）。能满足缺陷型菌株生长的培养基称完全培养基（CM）。
营养缺陷型广泛应用于氨基酸、维生素、核苷酸的生产菌株的选育方面。不仅作为遗传生化的研究对象，而且作为基因标记而广泛用于遗传学的研究中。
营养缺陷型菌株分离筛选，一般经过淘汰野生型、缺陷型的检出和鉴定等步骤。
①营养缺陷型菌株的浓缩：此过程的目的在于选择性地除去经中间培养后群体细胞中的野生型（原养型）细胞，即淘汰野生型细胞，从而提高缺陷型细胞分离和检出效率。
为了达到淘汰野生型，浓缩缺陷型细胞的目的，在进行营养缺陷型菌株浓缩前，需对诱变处理后经中间培养的培养物进行饥饿培养和2倍氮源培养。饥饿培养即将经中间培养的菌液，离心收集菌体，用生理盐水洗涤离心两次，将菌体置于无氮基本培养基中培养6～12h，使其游离的有机含氮化合物耗尽；2倍氮源培养即将上述培养液全部移入等量的含有2倍氮源的基本培养基中培养2～3h后，加入一定量抗生素、抑菌剂等，继续培养一定时间，由于野生型细胞在基本培养基中能生长繁殖，缺陷型细胞不生长繁殖，从而杀死或抑制野生型，达到浓缩缺陷型细胞的目的。应用菌丝过滤法，可直接用基本培养基培养野生型孢子萌发至形成菌丝，过滤除去菌丝，使缺陷型孢子得以浓缩。浓缩营养缺陷型突变株的方法有以下几种：
A。抗生素法：青霉素能抑制正在增殖的革兰氏阳性细菌的细胞壁合成，因而杀死野生型细胞，达到浓缩缺陷型细胞的目的。一般情况下，处理一次可浓缩103～104倍。但对休止状态细胞无此作用。用2mmol/L浓度的D-环丝氨酸处理大肠杆菌，结果同青霉素一样，使正在增殖着的细胞发生裂解，达到浓缩缺陷型细胞的目的。用浓度为10μg/mL的制霉菌素处理酵母菌细胞1h，因制霉菌素可大量渗入正在增殖的细胞中，从而选择性地杀死野生型细胞，也能达到浓缩缺陷型103～104倍的目的。
B。添加化学试剂法：那些对青霉素无效应的微生物，如青霉属、链霉菌属、芽孢杆菌属的菌株，可用25～50mg/mL的五氯酚处理其发芽的孢子，即可致死，而未发芽的孢子则有抗性。适当浓度的亚硫酸对霉菌发芽孢子有选择性杀死作用，因此可用来浓缩缺陷型细胞。另外，添加浓度为100～400μg/mL的2-脱氧葡萄糖可抑制粟酒裂殖酵母的细胞壁合成，使正在增殖着的细胞发生裂解，其效果与制霉菌素相似。
C。过滤法：此方法应用于丝状真菌。其原理是在基本培养基中，野生型孢子能萌发形成菌丝，而营养缺陷型孢子不能萌发。将经诱变处理后的孢子，在液体基本培养基中培养一定时间后，滤去菌丝，即可淘汰野生型，达到浓缩缺陷型的目的。如此重复几次，效果更好。
D。差别杀菌法：细菌的芽孢较营养细胞耐热。将经诱变处理的细菌芽孢接种在液体基本培养基中培养一定时间，野生型芽孢发育成营养体，此时加热至80，保温15min，即可被杀死；缺陷型孢子因为仍然保持为芽孢状态而保留下来得以浓缩。此种方法也同样适用于产孢酵母。酵母菌的有性孢子耐热程度高于营养体6～12，某些酵母菌的营养细胞在58处理4min，即可被杀死。
②营养缺陷型菌株的检出：经浓缩处理的菌液中，只是营养缺陷型比例增大，但并不是每个细胞都是缺陷型，还需要通过一定方法将其分离检出。缺陷型细胞的检出方法很多，主要有逐个检出法、夹层培养法、限量补充法、影印接种法等。
A。逐个检出法：将浓缩处理过的菌液稀释后涂布于完全培养基平板上，待长出菌落，然后逐个地用牙签按一定排列顺序点接到基本培养基和补充培养基或完全培养基的平板上。培养一定时间后，观察同一菌株在不同培养基上的生长情况。在完全培养基的某一位置上出现菌落，而在基本培养基平板的相对位置上却没有菌落生长，那么该菌株可能是营养缺陷型；在基本培养基上不生长，而在补充培养基上生长的菌株，则是该补充物的营养缺陷型。然后将其转接入完全培养基斜面中保存待测。
B。夹层培养法：将分装在试管中的10mL基本培养基融化后，冷却至45～50，加入适当稀释的经浓缩处理的菌液（每皿50～100个菌落），混匀，立即倾于预先准备好的基本培养基平板上，待凝固后培养1～2d。待野生型菌长出菌落后，从培养皿的背面用记号笔将长出菌落的地方作好标记。然后在其上加入融化冷却至45～50的10mL完全培养基，凝固后，培养2～3d。观察发现，在前次没有菌落的地方长出菌落。第二次长出的菌落可能是营养缺陷型。然后将其转移入完全培养基斜面保存。
C。限量补充培养法：将经适当稀释的浓缩处理液涂布于含有微量（0.01%以下）蛋白胨或0.1%完全培养基成分的基本培养基平板上。经培养后，野生型细胞迅速生长成较大菌落，而缺陷型细胞由于生长缓慢，能形成小菌落。这些小菌落大多数为营养缺陷型，将其转接入完全培养基斜面保存待测。
D。影印接种法：将经适当稀释的浓缩处理菌液涂布于完全培养基平板上（每皿50～100个菌落），经培养生成菌落。然后用影印接种工具，将此皿上的全部菌落严格对应地转接到一基本培养基平板上。经培养后，比较两平板上生长的菌落，如果在完全培养基上有菌落生出，而在基本培养基平板上相应部位没有菌落生出，那么此菌落为营养缺陷型。然后将其转接入完全培养基斜面中保存待测。
③营养缺陷型的鉴定：
A。氨基酸、维生素、核酸碱基三大类营养要求的鉴定：将生长在完全培养基斜面上的待测的营养缺陷型细胞或孢子，用无菌水洗下，经充分洗涤后，离心收集菌体，制成细胞浓度106～108个/mL的菌悬液，取1mL菌悬液于培养皿中，再倾入15mL融化并冷却到45～50的基本培养基中，充分混匀凝固制得含菌的待测平板。在平板背面用记号笔划三个区域，然后在平板上的三个区域上分别贴上蘸有氨基酸、维生素和核酸水解物的滤纸片。经培养后，发现某一物质的滤纸片周围出现微生物生长圈，说明该待测菌株在生长时需要补充该添加的营养物质，该菌株即某营养物质的营养缺陷菌株。
B。单一氨基酸营养缺陷的确定：一般采用生长谱法进行测定。首先将属于氨基酸一类缺陷型菌株分别制成待测平板（方法同上）。将待测平板背面用记号笔划为六个区域，在其上六个区域分别贴上蘸有各组氨基酸混合液的滤纸片，培养后观察滤纸片周围微生物生长圈。
④抗性突变株的筛选：抗性突变株筛选比营养缺陷型相对容易，只要有10-6频率的突变体存在，就能筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。
A。一次性筛选法：一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性突变株。噬菌体抗性菌株、耐高温菌株、耐高酒精度菌株和耐高渗透菌株常用此方法筛选。
B。阶梯性筛选法：即在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物，使大量细胞中少数具有抗性的突变株能在这种培养基上生长，筛选出抗药性突变株的方法。但是大多数的情况下，由于无法知道微生物的最大耐药性，因此，常采用梯度筛选法。
梯度筛选法就是先将10mL左右的一般固体培养基倒入培养皿中，并将皿底倾斜放置使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7～10mL含有适当浓度药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部分，其药物浓度越稀，造成一个由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。然后将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度的区域菌落密度大；反之则相反。从而在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性突变株。
梯度筛选法也可用于抗代谢拮抗物突变株的筛选。
（三）原生质体融合（protoplast fusion）
原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”（cell fusion）。原生质体融合技术始于1976年，最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物以及细菌和放线菌中也得到了应用。原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1（而诱变育种一般仅为10-8）。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及动、植物和人体的细胞。发生基因重组亲本的选择范围也更大了，原来的杂交技术一般只能在同种微生物之间，而原生质体融合可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。这为利用基因重组技术培育更多、更优良的生产菌种提供了可能。
微生物原生质体融合操作的主要步骤有：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
1.融合亲株的选择
根据融合目的，所选择的亲株应性能稳定，并带有遗传标记，以利于融合子的筛选。采用的标记为营养缺陷型、抗药性、温度敏感型、糖发酵和同化性能、呼吸缺失、形态和颜色等，但经常采用前两种标记。要求单一标记的菌株回复突变率应小于10-7，并做到基因互补是原生质体细胞融合的标志。选择标记也无需过多，若已知融合频度较高，为了减少标记对菌株正常代谢的干扰，也可用无标记或一个标记菌株作为融合的亲株，而选择对生产性状无影响的标记更为重要。
2.原生质体细胞制备
影响原生质体细胞制备的因素主要有：
①菌体的前处理：为了使细胞对酶更敏感，可将菌体作某些处理。如在细菌的培养液中加入亚抑制剂量的青霉素；酵母菌培养液中加入2-脱氧葡萄糖，以抑制细胞壁的正常合成；在放线菌的培养液中加入1%～4%的甘氨酸也能起到抑制细胞壁合成作用。或者以EDTA及巯基乙醇处理对数期的菌体，都会收到好的效果。
②菌体培养时间：细胞处于对数生长状态一般对酶的作用最敏感。但是，在对数的前期还是后期为好，按菌株不同而异。芽孢杆菌以对数期后期为好，放线菌培养到对数期至平衡期的转换点为最佳，而丝状真菌多采用孢子发芽形成发芽管的时期。
③酶浓度：不同微生物，不仅对酶的种类要求不同，而且对酶浓度的要求也有差别。例如，在制备大肠杆菌的原生质体细胞时，溶菌酶浓度控制在20～500μg/mL之内。而制备芽孢杆菌的原生质体时多采用酶浓度为100～250μg/mL。另外，最佳酶量还因菌体的不同生长期而异，如处理对数生长期的大肠杆菌，以酶量为100μg/mL为最佳，而处理处于饥饿状态下的则需250μg/mL的酶量。
④酶处理温度：以枯草芽孢杆菌为例，温度在25～40内，壁的消化时间随温度上升而缩短。但是，在较高温度下，破壁难于控制，且原生质体易损伤而影响原生质体的再生率。酵母菌多采用30下破壁，青霉菌采用0.8mol/L KCl配制的混合酶为好。一般来讲，细菌破壁温度偏高，酵母菌及霉菌偏低些。当遇到很难形成原生质体的微生物时，用改变温度的方法将是很奏效的。
⑤酶处理的pH：在pH稍有升降时，对于制备青霉菌和芽孢杆菌的原生质体影响不大，但缓冲液的离子浓度对其有影响，一般是酶浓度增加时，离子浓度应予减少。
⑥渗透压稳定剂：等渗透压在原生质体制备中，不仅保护原生质体细胞免于膨胀破裂，而且还有助于酶和底物的结合。渗透压稳定剂多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有机物和KCl、NaCl、NH4Cl、（NH4）2SO4等无机物。菌种不同，最佳稳定剂也不同。产黄青霉以NaCl、KCl为好，酵母菌多采用山梨醇和甘露醇，细菌则以蔗糖为好。采用无机物作为渗透压稳定剂有降低黏度的优点，易于离心收集原生质体。稳定剂的浓度一般均为0.3～0.8mol/L。
3.原生质体细胞融合
促融剂聚乙二醇（PEG）在原生质体细胞融合中起着重要作用。如果仅把两亲本的原生质体等量混合，融合频度很低或不发生融合，只有加入表面活性剂聚乙二醇，融合才能出现突破性的提高，这是因为聚乙二醇具有强力促进原生质体结合的作用。
在枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的原生质体融合中，采用PEG6000，浓度为36%，得到的融合频率为0.5%，而且发现PEG4000、PEG1000、PEG6000和PEG2000能得到相同的重组频度。在芽孢杆菌的融合中，PEG处理时间一般为1min。
在L型金黄色葡萄球菌的融合研究中，诱导重组的PEG浓度50%较40%有效，比30%更明显，PEG6000较PEG4000、PEG1000好。
在真菌原生质体融合中，PEG浓度要低些，一般采用25%～30%，采用PEG4000或PEG6000较好。
除PEG本身的因素外，细胞融合还受各种阳离子的存在和浓度的影响。已知需Ca2+，其浓度为0.01mol/L最合适。Mg2+也有促进融合作用。一般认为带负电荷的PEG与带正电荷的Ca2+、Mg2+因细胞膜表面的分子互相作用，使原生质体的表面带有极性，易于吸着融合。培养基中加入Na+和K+会降低融合频度。这可能是因为K+和Na+优先结合到质膜上，从而降低了Ca2+的刺激作用，以至降低了融合频度。融合液中的pH也很重要，在Ca2+存在下，碱性条件（最高pH9.0）能得到较高的融合频度；在缺乏Ca2+时，在低pH条件下，融合频度也较高。这可能涉及膜的氢键的融合。无Ca2+存在，低pH可能促进氢键形成键合。
融合的程序开始是由于强烈脱水而引起原生质体的粘合，不同程度形成聚集物，原生质体收缩并高度变形，大量粘着的原生质体形成非常紧密的接触，接着可能是接触处的裸露蛋白膜之间的脂-脂相互反应。由于Ca2+强烈地促进脂分子的扰动和重新组合，结果接触处形成小区域的融合，形成小的原生质桥，原生质桥逐渐增大，直至两个原生质体融合。但融合的具体机制仍不清楚。
另外，紫外线辐射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。近年来，灭活原生质体融合技术由于具有可以不用遗传标记等优点，而得到广泛的应用。
4.再生
原生质体是已经被脱去坚韧的外层细胞壁，失去了原有细胞形态的球状体，其外仅有一层厚度约1×10-8m的细胞膜。虽然它们具有生物活性，但它不是一种正常细胞，在普通培养基上也不能生长繁殖。所以它们不能正常地表达融合后的性状，必须使其细胞壁再合成，恢复细胞原来的形状。
再生的常用方法有三种。一种是将原生质体涂布到高渗培养基的底层，然后加一层软琼脂，例如巨大芽孢杆菌；一种是直接涂布于高渗培养基表面，采用高渗基本培养基，可以使营养互补的融合的原生质体再生，但菌落形成速度较慢，再生率也低，例如枯草芽孢杆菌；另一种方法是，将原生质体预先与再生培养的软琼脂混合，倾在再生基本培养基或再生选择培养基平板上，例如啤酒酵母。
能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3%～10%，真菌再生率一般在20%～80%。链霉菌再生率最高可达50%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。
5.融合子的选择
原生质体融合重组效率较常规杂交高得多。但由于菌株不同，融合方式不同，其融合频度相差很大。因此靠选择性遗传标记，融合子可以在各种选择性培养基上显示出来。由于原生质体融合后会出现两种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体；另一种只是质配，不核配，形成异核体。它们都能在再生基本培养基平板上形成菌落，但前者是稳定的，而后者则是不稳定的，在传代中将会分离为亲本类型。所以要获得真正的融合子，应该进行几代的分离、纯化和选样。
（四）基因工程
基因工程是20世纪70年代以后兴起的一门新的育种手段，即应用人工方法把生物的遗传物质，通常是脱氧核糖核酸（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接或重组，然后将重组了的DNA导入某种宿主或个体，从而改变它们的遗传品性，有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。
基因工程操作流程主要包括目的基因分离，与克隆载体重组，转入受体细胞，筛选和鉴定克隆子。分离目的基因常采用PCR技术从基因组DNA中扩增含目的基因的DNA片段，或者用分子杂交等方法从构建的cDNA文库和基因组文库中找出含目的基因的克隆子。克隆载体有质粒载体和病毒（噬菌体）载体以及它们彼此重组或与其他基因组DNA片段重组的载体，供不同实验要求选择使用。在DNA连接酶的作用下，含目的基因的DNA片段与克隆载体连接成为重组DNA分子，在连接之前，一般先分别用限制性内切酶切割，如有必要再用修饰酶修饰末端，使DNA片段待连接的两个末端成为互补黏性末端或平末端。重组DNA分子导入原核生物细胞可采用CaCl2处理的转化法、病毒颗粒感染的转导法和三亲本杂交法等；导入植物细胞常采用农杆菌介导的T质粒载体转化法、电穿孔法、微弹轰击法等；导入动物细胞常用的方法有病毒颗粒介导的病毒载体转导法、DNA磷酸钙沉淀物转染法和显微注射法等。筛选克隆子常采用克隆载体携带的选样标记基因、供体DNA携带的报告基因以及双酶切片段重组等方法。进一步鉴定克隆子采用限制性内切酶分析法、分子杂交法、PCR法、DNA测定法和免疫法等。
