然而，一件意外的突发事件，却令蒋经国和“救国团”遭到了美国的反对。朝鲜战争爆发后，美国总统杜鲁门决定命令第七舰队到台湾海峡巡弋，派美军第十三航空队入驻台湾。美国还从财政上积极援助台湾，1951年美方给予台湾经济援助达9804万美元，1952年对台援助总数为8184万美元，1953年增加到10550万美元。与此同时，美军正式向台湾派出“军事顾问团”，并在台湾成立了协防司令部。美军驻台人员于是急剧增加，1951年仅116人，而到1957年已增加到数千人，加上美国公民和眷属已超过1万人。根据1951年美国派遣《军事援华顾问团》之换文，驻台美军比照外交人员，享有“治外法权”，并不受台湾当地法律之管辖。
1953年7月朝鲜停战协定签订后，蒋介石为了让第七舰队继续留在台湾海峡，美国也为了保持台湾这艘“不沉的航空母舰”不致在大陆不断增强的军事压力下“沦陷”，双方决定缔结一项军事协定。1954年12月3日，《美台共同防御条约》在华盛顿签订。《条约》宣称“愿公开正式宣告其团结之精诚及其自卫而抵御外来武装攻击之共同决心”，台湾给予美国“依共同协议之决定，在台湾、澎湖及其附近为其防御所需要而部署美国陆海空军之权利”，美国则协助防御台澎地区。军事协定的签订，极大地增强了蒋介石“反攻大陆”的信心，他在日记中说：“‘中美互助协定’已于三日晨正式签订成立，此乃十年蒙耻忍辱苦撑奋斗之结果，从此我台湾反攻基地始得确立，大陆民心乃克振奋。此诚黑暗中一线之曙光。”然而，蒋介石这种借助外力自保，甚至不惜让美军驻台，牺牲领土主权完整的行为，进一步加剧了“美台”之间的不平等。美军驻台士兵自视为台湾的救世主，横行无忌，作威作福，经常强买强卖，酗酒滋事，甚至飞车伤人，欺辱妇女。而台湾当局为了拉住美国与大陆对抗，对美军的胡作非为往往姑息迁就，睁只眼闭只眼，反过来又对美军士兵的恶行起到纵容和怂恿的作用。台湾民众的反美情绪随着时间的推移逐渐积累，终于因刘自然被美军开枪打死而酿成大规模的反美运动。
1957年3月20日晚11时，美军顾问团上士雷诺在其台北市阳明山住宅门前，将任职于国民党“革命实践研究院”的少校军官刘自然开枪打死。案发后，台湾省警务处前来调查。雷诺声称案发时刘自然在偷窥其妻入浴，被发现后也不离去，他始自室内持枪而出，刘自然企图用木棍加害，雷诺乃开枪自卫。刘侧身跑数步，跌仆水泥道旁。他欲返家电话报警，行十余步，见刘捧胸起立欲逃，遂又对准发射一枪。刘负伤逃往公园，最终丧命。但警务处调查后认为，雷诺所称事出自卫，多难采信，而有杀人之故意，非为正当防卫。
按照中国人的传统，杀人者偿命乃天经地义之事。无奈台美间有协议在先，美军在台官兵享有“外交豁免权”，美军官兵犯法只能由美军在台的“军事法庭”审判，台湾当局无权过问。
5月23日，美“军事法庭”宣布雷诺枪杀刘自然系“误杀”，并以“罪嫌不足”判雷诺无罪，予以释放。由于美国统一军法规定，军事法庭“无罪”之判决，不须经其军事长官审核，一经判决，即生效力。就在雷诺宣判无罪同时，美军当局也在安排雷诺及其家属尽快离开台湾。
消息传出，台湾舆论哗然，均认为美“军事法庭”的判决“不合理”、“不公正”、“太霸道”，“此案如此定案，实开一恶例，我人民将毫无保障矣！”“台北地方法院”也认为雷诺枪杀刘自然并不具备“正当防卫”的要件。台湾当局迫于舆论压力，不得不由“外交部”出面向美方“交涉”。但美方根本不把台湾当局放在眼里，认为依据美国法律，“军事法庭”宣判无罪后，不能上诉和重审。
5月24日上午10时，刘自然的妻子奥特华身着黑衣，手举分别用中、英文写有“杀人者无罪？我控诉！我抗议！”的牌子，来到美驻台“大使馆”门前抗议。很快就有三四百名台北市民上前围观、声援。国民党警察曾威胁要其离去，但遭奥特华拒绝。她声泪俱下地向围观群众哭诉，发誓要为丈夫讨回公道。当人们听到她“我今天在这儿，不光是为我无辜的丈夫作无言的抗议，我是为中国抗议”的话时，在场民众无不群情激愤，他们高呼“美帝国主义从台湾滚出去”、“还我公道”等口号，将美国“大使馆”团团围住。
到下午1时许，声援民众已近数千人。此时，雷诺离台之消息业经电台播出，终于激起了众怒。先是有人以石子投掷美“大使馆”玻璃窗，后有人翻墙进入“大使馆”，打开铁门，外面愤怒的民众一拥而入。他们砸烂美国“大使馆”的牌子，扯下星条旗踩在脚下，捣毁门窗和办公室的家具，放火焚烧了“使馆”的汽车、文件，并在墙上刷下“美国佬滚出去！”的标语。与此同时，台北的美国新闻处及美军台湾协防司令部也遭到了市民的围攻。
事发后，台湾当局先后出动警察、宪兵使用高压水龙头、催泪瓦斯等，最后不得不调动卫戍部队才将人群驱散，直至晚上9时，事态才逐步平息。据官方公布，此次冲突有1人死亡，2人重伤，24名警员受伤。这就是震惊岛内外的“五二四”反美事件。
事件引起了美国朝野的强烈反应。24日晚，“驻华大使”蓝钦自香港匆匆返台，向“外交部”提出强烈抗议，并要求台湾当局保护美在台人员安全，赔偿一切损失。美国总统艾森豪威尔也声明，大规模的反美事件，“不似一无组织的行为”。美国媒体甚至公开认为蒋经国是幕后的操纵者，“救国团”是背后的策动者。
26日，蒋介石接见了蓝钦“大使”，并表示：此次不幸事件，系一般中国人民对雷诺案审判结果不满而发生，决非此间有任何反美运动。然而，蓝钦却表示，就他所得的报告显示，此次事件是自发性与有计划的混合体。美国中央情报局长在第325次国家安全会议中，认为“此次动乱一开始就是经过非常仔细的计划，刘妻有若干官方的支持”。
蒋介石对于美方坚持“五二四”事件是一件有计划的反美运动，深感不安。他很清楚美国人在怀疑蒋经国。为此，他派“外交部长”叶公超会务蓝钦，表示：“‘总统’本人对此说殊为震惊，竟有人如此怀疑，诚属不可思议。倘确有其事，则蒋经国之行为实违背‘总统’及国家之利益。”
蒋经国本人对于美国的指责，一方面公开表示台湾并无反美意识，另一方面也向“外交部”出示了他在5月23日给“救国团”的指令。其内容为：
闻今日晚报登出美“军事法庭”宣判雷诺无罪后，各校学生皆有不平之情绪，有若干学校且甚愤激。此一情形，本团应密切加以注意，以免被人利用操纵，举行罢课游行与请愿等事，以造成扰乱社会秩序之现象。更可虑者，在此情绪不安情况之中，不法分子可能制造事件，破坏“中美关系”。本团应即指示各学校团部，一切皆应本相信政府之态度，听候政府依法律与外交途径解决之。如有意见可书面提出之。
但美方并没有消除对蒋经国和“救国团”的怀疑。9月12日，美国总统特别助理李查兹偕同美国副国务卿赫特飞抵台北，对“五二四”事件后的台湾情势进行评估。李查兹曾当面对蒋介石说：“美国国会与人民不解，为何当时没有采取强力措施，以阻止此不幸事件？在美国有广泛的报道认为蒋经国所指挥的‘救国团’成员，在此次暴乱中扮演了积极的角色。”李查兹认为，至少蒋经国以及他领导的“救国团”，事先应该知道当日“大使馆”前的有组织抗议活动。
事情的发展对蒋经国和“救国团”都非常的不利，甚至有人建议取消“救国团”。当时，李焕曾建议蒋经国可以写几篇文章或者发表正式谈话，澄清他和“救国团”没有参与事件，“救国团”是被冤枉的，但蒋经国表示这样一来，会更加引起外界对此事件的注意。他说：“此时国家的处境已经非常艰苦，现在这个时候发表谈话只会引起更多的是非，我们要有‘打落牙齿和血吞’的胸怀，相信是非曲直将来总会明白的。”
果然，“五二四”事件之后，很长时间蒋经国的行迹暂时从报章杂志上消失，拒绝记者访问报道，很少出现在公开场合，而将大部分时间和精力投入到服务“荣民”和修筑中横公路上了。
