植物的组织培养相对于动物来说,比较简单,因此,科学家们是首先以植物作为攻克难关的突破口的。植物组织培养即植物无菌培养技术,是根据植物细胞具有全能性的理论,利用植物体的某一部分器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下,能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根,最后形成完整的植株。
19世纪30年代,德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说。他们认为如果给细胞提供和生物体内一样的条件,那么每个细胞都应该能够独立生活。德国科学家哈伯兰特在此基础上,提出了细胞全能论。1958年,一个振奋人心的消息从美国传遍世界各地,美国植物学家斯特瓦特等人,对胡萝卜皮上部的细胞进行培养,终于得到了完整植株,并且这一植株能够开花结果。这项实验的成功证实了哈伯兰特在50多年前关于细胞全能性的预言。
植物组织培养的大致过程是:在无菌条件下,将植物器官或组织(如芽、茎尖、根尖或花药)的一部分切下来,放在适当的人工培养基上进行培养,这些器官或组织就会进行细胞分裂,形成新的组织。不过这些组织没有发生分化,只是一团薄壁细胞,叫做愈伤组织。然后在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下,愈伤组织便开始分化出植物的各种器官和组织,进而发育成一棵完整的植株。
1.植物组织培养的步骤
(1)将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细清洗干净。把材料切割成适当大小的体积,以能放入灭菌容器为宜。放在自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而定。易漂浮或细小的材料,需要装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质,是一种非离子,比如吐温型去污剂。
(2)对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10~30秒。由于酒精可以使植物材料的表面被浸湿,加之70%酒精穿透力强,很容易伤害植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片和苞叶等的孕穗、多层鳞片的休眠芽等等,则可用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。
(3)用灭菌剂处理。灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1~2种。
(4)用无菌水涮洗,涮洗每次3分钟左右,视采用的消毒液种类,涮洗3~10次左右。无菌水涮洗的目的是消除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
在组织培养的过程中,需要注意的是:①酒精渗透性强,幼嫩材料易在酒精中失绿,所以浸泡时间要短,防止酒精杀死植物细胞。②老熟材料,特别是种子等可以在酒精中浸泡的时间长一些,如种子可以浸泡5分钟。③升汞的渗透力弱,一般浸泡10分钟左右,对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿,所以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为0.08%~0.12%的吐温20或80(一种湿润剂),可以降低植物材料表面的张力,达到更好的消毒效果。
2.植物组织培养的种类
根据组织培养所利用的外植体的不同,可以将其分为5种类型:
(1)胚胎培养
以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟的胚为外植体的离体无菌培养,我们称之为胚胎培养。
(2)器官培养
以植物的根、茎、叶、花、果实等器官为外植体的离体无菌培养,我们称之为器官培养。如根的根尖和切段,茎的茎尖、茎节和切段,叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶,花器的花瓣、雄蕊(花药、花丝)、胚珠、子房、果实等均可作为外植体。
(3)组织培养
指以分离出植物各部位的组织(如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等),或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。
(4)细胞培养
以单个游离细胞(如用果酸酶从组织中分离的体细胞,或花粉细胞、卵细胞)为接种体的离体无菌培养,我们称之为细胞培养。
(5)原生质体培养。
以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养,我们称之为原生质体培养。