（6）污染物鉴别：采用恒能量同步荧光光谱法可以定量测定苯并［a］芘的含量。加标回收率大于85%，相关系数大于0.9995，相对标准偏差为0.86%。利用三维荧光光谱研究PAHs中菲的荧光光谱特性，选择在激发波长255 nm、发射波长370 nm对菲进行定量分析，菲溶液在5.0～250.0 ng/mL的范围内工作曲线呈线性关系，检出限为3.88 ng/mL，相对标准偏差为4.23%(n=5)，对自来水样品的测定，回收率为90.0%～105.4%。利用苏丹红II和III的荧光现象所建立的同步荧光分析新方法无须预分离，通过选择适当的波长差，只需一次扫描就可以同时测定苏丹红II和III两种物质，检出限分别为14 μg/kg和11 μg/kg，与国家标准方法（GB/T 19681-2005）的检出限(10 μg/kg)结果相近。
（7）食品成分分析：采用同步荧光法固定波长差扫描技术，可同时测定功能饮料中维生素B2和B6，检测红葡萄酒中白藜芦醇含量加标回收率达96.8％～97.9％之间。
16.3色谱分析法
16.3.1概述
色谱法是1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特（Mikhail Semyonovich Tsvet）将植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，试图分离它们时发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。其后的一个重大进展是1941年发现了液-液（分配）色谱法［Liquid-lipuid（Partition）Chromatography，LIC］。覆盖于吸附剂表面并与流动相不混溶的固定液被用来代替以前仅有的固体吸附剂，试样组分按照其溶解性在两相之间分配。在使用柱色谱的早期年代，可靠鉴定小量的被分离物质很困难，所以研究发展了纸色谱法（Paper Chromatography，PC），在这种“平面的”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配实现的。然后由于充分考虑了平面色谱法的优点而发展了薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC），在这种方法中，分离在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。气相色谱法1952 年出现，现已成为所有色谱法中使用最广泛的一种，特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体，即使对于很复杂的混合物，其分离时间也仅为几分钟左右。分辨率高、分析迅速和检测灵敏等优点使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常规方法。近来，因为新型液相色谱仪和新型柱填料的发展以及对色谱理论的更深入了解，又重新引起对密闭柱液相色谱法的兴趣。高效液相色谱法（High-performance Liquid Chromatography，HPLC）迅速成为与气相色谱法一样广泛使用的方法，对于迅速分离非挥发性的或热不稳定的试样，高效液相色谱法的优势明显。
16.3.2色谱法分类
16.3.2.1按两相状态分类
液体作为流动相，称为“液相色谱法”（Liquid Chromatography）；用气体作为流动相，称为“气相色谱法”（Gas Chromatography）。固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相，所以色谱法按两相所处的状态可以分为：液-固色谱法（Liquid-solid Chromatography）、液-液色谱法（Liquid-liquid Chromatography）、气-固色谱法（Gas-solid Chromatography）和气-液色谱法（Gas-liquid Chromatography）。
16.3.2.2按分离原理分类
（1）吸附色谱法（Adsorption Chromatography）：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。吸附色谱法常叫做液-固色谱法（Liquid-solid Chromatography，LSC），它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用，将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，例如硅胶、氧化铝和活性炭等。活性点位如硅胶的表面硅烷醇，一般与待分离化合物的极性官能团相互作用。分子的非极性部分（例如烃）对分离只有较小影响，所以液-固色谱法十分适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。吸附色谱利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。吸附色谱的分配系数表达式如下：
Kα=［Xα］［Xm］
式中：X——被吸附于固定相活性中心的组分分子含量；
Xm——游离于流动相中的组分分子含量。
分配系数对于计算待分离物质组分的保留时间有很重要的意义。
（2）分配色谱法（Partition Chromatography）：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的方法。在分配色谱法（也称液-液色谱法）中，溶质分子在两种不相混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。固定相均匀地覆盖于惰性载体——多孔的或非多孔的固体细粒或多孔纸上（纸色谱）。为避免两相的混合，两种分配液体在极性上必须显着不同。通常的操作方式为，若固定液是极性的（例如乙二醇），流动相是非极性的（例如乙烷），那么极性组分将较强烈的被保留。另一方面，若固定相是非极性的（例如癸烷），流动相是极性的（例如水），则极性组分易分配于流动相，从而洗脱得较快。后一种方法（它有相反的极性）称作为反相液-液色谱法。由于溶解度差别的细微效应，所以液-液色谱法很适于分离同系物的同分异构体。在液-液色谱法中，固定相几乎都被化学键合在载体物质上，而不是机械覆盖在它的表面，这种色谱法称作键合相色谱法（Bonded-phase Chromatography，简称 BPC），方法的机理尚不清楚，可能是分配机理，也可能是吸附机理，视实验条件而定。高效液相色谱法中，键合相色谱法的应用远远超过所有其他模式。分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠涂布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。分配色谱狭义的分配系数表达式如下：
K=CSCm=Xs/VsXm/Vm
式中：CS——组分分子在固定相液体中的溶解度；
Cm——组分分子在流动相中的溶解度。
(3)离子交换色谱法（Ionexchange Chromatography）：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同而进行分离的方法。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。离子交换色谱的分配系数又叫做选择系数，其表达式为：
Ks=［RX+］［X+］
式中：RX+——与离子交换树脂活性中心结合的离子浓度；
X+——游离于流动相中的离子浓度。
（4）凝胶色谱法（Gel Chromatography）：利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异进行分离的技术。凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中。不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶胀状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。
16.3.2.3按操作形式分类
（1）柱色谱法（Column Chromatography）：柱色谱法是将固定相装在金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。
（2）纸色谱法（Paper Chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，显色后，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。
（3）薄层色谱法（Thin-layer Chromatography）：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
（4）离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography）：1956年离子交换基团首次被结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。
（5）尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography）：别名空间排阻色谱法、体积排阻色谱法、凝胶排阻色谱法和分子色谱排阻法，按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
（6）亲和色谱法(Affinity Chromatography)：相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质一方与不溶性担体形成共价结合化合物作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。在食品分析的应用中，农药兽药残留分析中应用较多。
16.3.3色谱基本理论
16.3.3.1保留时间理论
保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。
保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：
tR=t0(1+KVS/Vm)
式中：tR——某物质的保留时间；
t0——色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定；
K——分配系数；
VS，Vm——固定相和流动相的体积。
这个公式又叫做色谱过程方程，是色谱学最基本的公式之一。
在薄层色谱中没有样品进入和流出固定相的过程，因此人们用比移值标示物质的色谱行为。比移值是一个与保留时间相对应的概念，它是样品点在色谱过程中移动的距离与流动相前沿移动距离的比值。与保留时间一样，比移值也由物质在色谱中的分配系数决定：
Rf=VmVm+KVs
式中：Rf——比移值；
K——色谱分配系数；
Vs，Vm——固定相和流动相的体积。
16.3.3.2塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论。塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。色谱柱的塔板数越多，其分离效果越好。
根据塔板理论，待分离组分流出色谱柱时的浓度随时间呈现二项式分布，当色谱柱的塔板数很高时，二项式分布趋于正态分布。流出曲线上组分浓度与时间的关系可以表示为：
Ct=C0σ2πe-（t-tR）22σ2
式中：Ct——t时刻的组分浓度；
C0——组分总浓度，即峰面积；
σ——半峰宽，即正态分布的标准差；
tR——组分的保留时间。
该方程称作流出曲线方程。
