吸附分离：将处理后所得的溶液加热至70℃，加入聚酰胺粉充分搅拌，用柠檬酸溶液调pH值至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附着色剂的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤)。用pH=4的70℃水反复洗涤，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇一甲酸溶液洗涤1～3次，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至2 mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。
聚酰胺粉在偏酸性（pH值为4～6）条件下对色素吸附力较强。如溶液中仍有颜色，可再加入少量的聚酰胺粉。如样品色素浓度太高，要用水适当稀释，因为在浓溶液中，色素钠盐的钠离子不容易解离，不利于聚酰胺粉吸附。
样液中的色素被聚酰胺粉吸附后，用经20%柠檬酸调节pH值至4的70℃水反复洗涤。若含天然色素，可用甲醇-甲酸溶液洗涤至无色，再用70℃水洗涤至中性。
用乙醇-氨溶液分次解吸色素，收集全部解吸液，水浴驱氨。若是单一色素，用水定容，用分光光度计比色；若为混合色，将解吸液水浴浓缩，转入容量瓶中，用50%乙醇洗涤、定容。
苋菜红与胭脂红用甲醇-乙二胺-氨水 （10+3+2）展开剂； 靛蓝、 亮蓝用甲醇-氨水-乙醇 （5+1+10）展开剂； 柠檬黄与其他色素用柠檬酸钠溶液（25g/L）-氨水-乙醇（8+1+2）展开剂。
测定波长分别为胭脂红510 nm、苋菜红520 nm、柠檬黄430 nm、日落黄482 nm、亮蓝627 nm、靛蓝620 nm。
13.7.3示波极谱法
食品中的合成着色剂，在特定的缓冲溶液中，在滴汞电极上可产生敏感的极谱波，波高与着色剂的浓度成正比，当食品中存在一种或两种以上互不影响测定的着色剂时，可用其进行定性定量分析。
不同样品的处理方法如下。
（1）饮料和酒类：加热驱除CO2和乙醇，冷却后用NaOH和HCl调至中性，然后加蒸馏水至原体积。
（2）表层色素类：用蒸馏水反复漂洗直至色素完全被洗脱，合并洗脱液并定容至一定体积。
（3）水果糖和果冻类：用水加热溶解，冷却后定容。
（4）奶油类：放入离心管中，用石油醚洗涤3次，用玻棒搅匀，离心，弃上清液。低温挥发，除去残留的石油醚后用乙醇-氨溶液溶解并定容，离心，取一定量上清液水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗入容量瓶并定容。
（5）奶糖类：溶于乙醇-氨溶液，离心。取上清液，加水，加热挥发，除去氨，冷却，用柠檬酸调至pH=4，加入200目聚酰胺粉，充分搅拌使色素完全吸附后，用酸性水洗入离心管，离心，弃上层液体。沉淀物反复用酸性水洗涤3～4次后，用适量酸性水洗入含滤纸的漏斗中。用乙醇-氨溶液洗脱色素，将洗脱液在水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗入容量瓶并定容。
13.7.4其他方法
（1）分光光度法：将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸色素，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，水浴上挥发去氨，移入比色管中，用水稀释至适当的浓度，在标准参照下，于最大吸收波长处测定吸光度，可知其含量，根据吸收光谱可确定为何种色素。用分光光度法测定混合食用合成色素时，常采用最小二乘法的多波长线性回归光度法，但最小二乘法受异常点影响显着，且对测量波长的位置等条件要求严格。
（2）微柱法：聚酰胺-硅胶填充的微柱法是根据水溶性酸性合成色素在酸性条件下被聚酰胺吸附，在碱性条件下被解吸的特性，利用被分离物质在吸附剂与展开剂之间分配系数不同，达到分离目的。
（3）紫外-可见吸收光谱法：根据物质对光的吸收具有选择性，应用紫外-可见分光光度计进行吸收光谱扫描，发现胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄和靓蓝等5种不同的食用合成色素具有不同的吸收谱图，与标准谱图对照，即可直观、快速地定性，且一定浓度下，峰高与含量成正比，可以定量检测，从而建立了紫外-可见吸收光谱法测定食用合成色素。
（4）纸层析法：纸层析法是以滤纸作为支撑体的分离方法，利用滤纸吸湿的水分作固定相，有机溶剂作流动相。流动相由于毛细作用自下而上移动，样品中的各组分将在两相中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同溶质随流动相移动的速度不等，因而形成与原点距离不同的层析点，达到分离的目的。
（5）气相色谱法：水溶性酸性染料在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。气相色谱测定使用合成色素时，样品中的脂肪、糖类、蛋白质等对测定有影响，水溶性杂质需用热水洗涤除去；脂肪用石油醚、丙酮洗涤脱脂，蛋白质用钨酸钠澄清剂沉淀分离，天然色素用甲醇-甲酸除去。
（6）微机极谱法：苋菜红、胭脂红、柠檬黄、赤藓红、诱惑红和日落黄等着色剂在磷酸盐缓冲溶液中，于滴汞电极上可产生导数极谱波，亮蓝在乙酸盐缓冲溶液中，于滴汞电极上可产生导数极谱波，波高与着色剂的含量成正比。
食品分析
13.7.5几种方法的比较
微柱法能很好的解决天然色素红曲米的广泛使用，给许多分析测定带来干扰问题，且不需特定的实验条件，使用的仪器设备简单。极谱法具有结果准确度高，检出限低，干扰少的优点，且样品处理无特殊的要求，较其他方法简单，只需选择好测定介质即可。极谱法适宜于食品中混合色素的分析，测定所用汞如果操作处理不当会给环境带来很大的污染问题，是方法的一点不足。紫外吸收光谱法的优点是测定线性范围宽，灵敏度高，操作简便、快速、准确，易普及推广，但如果存在多组分共存时，有些吸收峰可能存在叠加现象，对测定造成很大的误差。高效液相色谱法所用仪器设备比较昂贵，工作条件要求比较高，在一些基层单位不容易普及推广。此外国家标准方法采用梯度洗脱单波长检测，在该条件下会产生较严重的基线漂移，灵敏度较差，有待改进。但HPLC法对色素分析具有干扰小、测定快速、准确、简便的特点，是色素现代分析仪器分析测定的发展趋势。薄层色谱法简便快捷、现象明显、经济实用、结果可靠，尤其适合于基层检测机构及小工厂的有关食品检验。采用聚酰胺-硅胶填充的微柱法测定食用合成色素，不需特定实验环境，操作简便、快速。
复习思考题
1.高效液相色谱法测定苯甲酸及苯甲酸钠的原理及要求是什么？
2.硫代巴比妥酸分光光度法测定山梨酸及山梨酸钾的原理及要求是什么？
3.气相色谱法测定BHA和BHT的原理及要求是什么？
4.离子色谱法测定亚硝酸盐的原理及要求是什么？
5.分光光度法测定亚硝酸盐的原理及要求是什么？
6.盐酸副玫瑰苯胺比色法测定二氧化硫和亚硫酸盐的原理及要求是什么？
7.薄层色谱法测定糖精钠的原理及要求是什么？
8.蒽酮比色法测定甜菊糖苷的原理及要求是什么？
9.高效液相色谱法测定食品合成色素的原理及要求是什么？
