(1)菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌(Saccharomyces Carlsbergernsis ATCC No.9080简称SC)纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在(30±0.5)℃恒温箱中保温18～20 h，取出于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存数星期以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天移种1次，连续2～3 d，方可使用，否则生长不好。
(2)种子培养液的制备：加0.5 mL 50 ng/mL的维生素B6标准应用液于尖头管中，加入5 mL基本培养基，塞好棉塞，于高压锅121 ℃下消毒10 min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。每次可制备2～4管。
(3)样品制备：取样0.5～10.0 g(维生素B6含量不超过10 ng)放入100 mL锥形瓶中，加0.22 mol/L H2SO4 72 mL，放入高压锅121 ℃下水解5 h，取出，于水中冷却，用10 mol/L NaOH和0.5 mol/L H2SO4调pH至4.5，用溴甲酚绿做指示剂（指示剂由黄色变成黄绿色）。将锥形瓶内的溶液转移到100 mL容量瓶中，定容至100 mL，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测（保存期不超过36 h），此为样液。
(4)接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两根管，在(30±0.5)℃的恒温箱中培养18～20 h。取出离心10 min(3000 r/min)，倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10 mL消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。
每个试样各测定管的吡哆醇含量为ρ1、ρ2、ρ3；取液量分别为V1、V2、V3，各样管的吡哆醇含量ρ为：
ρ＝ρ1V1+ρ2V2+ρ3V33(ng/mL)
样品重为m(g)，取液量为V(mL)，定容至100 mL，则样品的吡哆醇含量为：
ω=ρ×V×102m×106=ρ×Vm×104（mg/100g）
说明及注意事项如下。
(1)所有步骤需要避光处理。
(2)试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡1 d左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，晾干，方可再用。
12.2.2.4维生素C的测定
维生素C，又称抗坏血酸、抗坏血病维生素，为水溶性的维生素。它是一种不饱和的多羟基化合物，以内酯形式存在，在2位与3位碳原子之间烯醇羟基上的氢可游离H+，所以具有酸性。自然界存在还原型和氧化型两种抗坏血酸，都可被人体利用。它们可以互相转变，但当氧化型（DHVC）一旦生成二酮基古洛糖酸或其他氧化产物，则活性丧失。
抗坏血酸脱氢抗坏血酸二酮基古洛糖酸
维生素C主要食物来源为新鲜蔬菜与水果，如西兰花、菜花、塌棵菜、菠菜、柿子椒等深色蔬菜和花菜，以及柑橘、红果、柚子等水果含维生素C量均较高。野生的苋菜、苜蓿、刺梨、沙棘、猕猴桃、酸枣等含量尤其丰富。维生素 C 难溶于脂肪，易溶于水，其水溶液具有酸性，对酸稳定，遇碱或遇热极易破坏，具有较强的还原性，易氧化，铜盐可促进其氧化。
测定维生素 C 的方法有 2，6-二氯靛酚滴定法，2，4-二硝基苯肼比色法、荧光法、高效液相色谱法等。
12.2.2.4.12，6-二氯靛酚滴定法
具有烯醇式分子结构的抗坏血酸分子具有还原性，在中性或弱酸性条件下能定量还原2，6-二氯靛酚染料为无色。此染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。终点时，稍过量的2，6-二氯靛酚使溶液呈现微红色。根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。
样品中维生素C含量根据下列公式计算：
X＝T×(V－V0)m×5100×100
式中：X——样品中维生素C的含量，mg/100g；
T——1 mL染料溶液(2，6-二氯靛酚溶液)相当于维生素C的质量，mg；
V——滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL；
V0——滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL；
m——样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)2，6-二氯靛酚滴定法测定的结果为食品中的还原型L-抗坏血酸含量，而非维生素C总量。此法是测定还原型L-抗坏血酸最简便的方法，适合于大批果蔬，但对红色果蔬不太适宜。
(2)维生素C在酸性条件下较稳定，故样品处理或浸提都应在弱酸性环境中进行。浸提剂以偏磷酸(HPO3)稳定维生素C效果最好，但价格较贵。一般可采用2%草酸代替偏磷酸，价廉且效果也较好。
(3)测定维生素C时，应尽可能分析新鲜样品，在不发生水分及其他成分损失的前提下，样品尽量捣碎，研磨成浆状。需特别注意的是：研磨时，加入与样品等量的酸提取剂以稳定维生素C。
(4)所有试剂应用新鲜重蒸馏水配制。
(5)测定过程中应避免溶液接触金属、金属离子。
(6)样品匀浆在100 mL容量瓶中，可能出现泡沫，可加入戊醇2～3滴消除之。同时作空白实验，消除系统误差。
(7)整个操作过程应迅速，滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色15 s内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较慢，故滴定终点以出现红色15 s不褪色为终点。
12.2.2.4.22，4-二硝基苯肼法
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮基古洛糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。
样品中抗坏血酸含量根据下列公式计算：
X＝ρ×Vm×f×1001000
式中：X——样品中抗坏血酸含量，mg/100 g；
ρ——由标准曲线得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL；
V——试样用1%草酸溶液定容的体积，mL；
f——样品氧化处理过程中的稀释倍数；
m——样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)苯肼比色法容易受共存物质的影响，特别是谷物及其加工食品，必要时可用层析法纯化。
(2)实验过程应避光操作。
(3)硫脲可保护抗坏血酸不被氧化，且可帮助脎的形成。最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。
(4)试管从冰水中取出后，样品中因糖类的存在会造成颜色逐渐加深，故必须计时，30 min后准时比色。
12.2.2.4.3荧光法
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹喔啉。其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 OPDA 反应，以此排除样品中荧光杂质产生的干扰。
样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量根据下列公式计算：
X＝ρ×Vm×f×1001000
式中：X——样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；
ρ——由标准曲线查得或由回归方程算得的样品溶液浓度，μg/mL；
V——荧光反应所用试样体积，mL；
f——样品溶液的稀释倍数；
m——样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)实验全部过程应避光。
(2)活性炭用量应准确，其氧化机理是基于表面吸附的氧进行界面反应，加入量不足，氧化不充分；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用。实验证明，2g用量时，吸附影响不明显。
(3)邻苯二胺溶液在空气中颜色会逐渐变深，影响显色，故应临用现配。
复习思考题
1.三氯化锑比色法测定维生素A的原理是什么？
2.三氯化锑比色法测定维生素D的原理是什么？
3.荧光法测定维生素E的原理是什么？
4.纸层析法测定胡萝卜素的原理是什么？
5.荧光法测定维生素B1的原理是什么？
6.硅镁吸附剂净化荧光法测定维生素B2的原理是什么？
7.微生物法测定维生索B6的原理是什么？
8.2，6-二氯靛酚滴定法测定维生素 C的原理是什么？结果是还原态的、氧化态的还是总的抗坏血酸？
9.2，4-二硝基苯肼法测定维生素 C的原理是什么？
