1.试剂配制
（1）苏木素液。常用Harris苏木素液或Gill改良苏木素液。
Harris苏木素液配方：
苏木精1g、无水乙醇10ml、硫酸铝钾20g、蒸馏水200ml、氧化汞0.5g、冰醋酸8ml。
先将苏木精溶于无水乙醇中备用。将硫酸铝钾放入蒸馏水，加热溶解，再加入备用的苏木精，煮沸2min；停止加热，立即加入少量的氧化汞，防止氧化过程中苏木精外溢，玻棒搅拌，边搅拌边加入氧化汞；立即移至冰水中，加速其冷却，静置一夜后过滤备用。使用前以4%～5%的比例加入冰醋酸并混匀。
Gill改良苏木素液配方：
苏木精2g、无水乙醇250ml、硫酸铝17.6g、蒸馏水750ml、碘酸钠0.2g、冰醋酸20ml。
先将苏木精溶于无水乙醇中，硫酸铝溶于蒸馏水中，然后两液混合后加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。
（2）盐酸‐乙醇液、浓盐酸0.5ml70%、乙醇100ml。
（3）稀碳酸锂液，在100ml蒸馏水中，加饱和碳酸锂1滴。
（4）橙黄G6液、橙黄G60.5g、蒸馏水5ml、无水乙醇85ml、磷钨酸0.015g。
先将橙黄G6溶于蒸馏水中，再加入无水乙醇，然后加入磷钨酸，贮于棕色磨口瓶中，用时过滤。
（5）EA染液。常用EA36染液或EA50染液。
EA36储备液：
A液：亮绿0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。
B液：伊红Y0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。
C液：俾士麦棕0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。
EA36工作液：
EA36储备液的A液45ml、EA36储备液的B液45ml、EA36储备液的C液10ml、磷钨酸0.2g、饱和碳酸锂水溶液1滴。
EA50染液配方：
3%亮绿水溶液10ml、纯甲醇250ml、20%伊红溶液20ml、冰醋酸20ml、磷钨酸（水溶后加入）2g、85%乙醇700ml。
2.染色步骤
（1）85%酒精溶液固定10～15min。
（2）清水冲洗1min。
（3）苏木素染核3～5min，如用Harris苏木素，必要时进行分化即盐酸‐乙醇液分化20～30s，至涂片呈淡橙红色，取出流水漂洗干净。
（4）用水或碱水反蓝，碱水反蓝需再入清水冲洗以去碱液，比如：稀碳酸锂溶液蓝化2min，涂片变蓝色，流水漂洗干净。
（5）85%酒精溶液脱水。
（6）橙黄G6液10s。
（7）85%酒精两道漂洗。
（8）EA36液或EA50液30～60s。
（8）85%酒精两道漂洗。
（10）无水酒精两道脱水。
（11）二甲苯两道透明。
（12）中性树胶封片。
3.染色结果。细胞核呈深蓝色，核仁更深带紫，鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞浆染淡绿色，表层不全角化细胞胞浆染粉红色，完全角化细胞胞浆呈橘红色，红细胞染鲜红色，白细胞的胞浆呈淡蓝绿色，黏液染淡蓝色或粉红色。
4.注意事项
（1）如前染色原理所述，EA36染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，必须把染液pH值调至5.2为宜。EA36染液pH值的测试，可用石蕊试纸法或酸度计法但以酸度计法最为准确。
（2）许多人使用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试，方法简便且同样可获得满意的染色效果。具体做法：拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸；若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂，并充分混匀，直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。
（3）磷钨酸在染色过程中，不但作为促染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，作为缓冲剂可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果。若涂片经EA36染色后，镜下观察效果不理想时，根据涂片着色情况，可于EA36染液中滴加少量10%磷钨酸或饱和碳酸锂后重染EA363～5min而补救。若角化细胞浆不红，可滴加10%磷钨酸。若角化前细胞浆也变红，可滴加饱和碳酸锂，如此边复染边镜下观察，直至获得最佳染色效果为止。
（4）分色或酸化，对染色效果也很重要。经分色后的胞浆在镜下观察应以无色为佳。若胞浆中还残留有苏木素染料，则影响EA36染液的着色。分色时间不宜过短或过长，每次在数秒内完成。盐酸浓度以0.5%为好，以便于掌握分色的时间。
（5）经过蓝化或碱化，胞核紫中带蓝与红色的胞浆对比明显。蓝化所用的碳酸锂是一种弱碱，还可中和分色时可能残留下的少量盐酸，为EA36的着色创造良好条件。因此蓝化时间可适当长些，以肉眼观察涂片变蓝为好。
（6）EA50染液配方稍复杂，但不易沉淀，染色效果较EA36稳定。
（7）每个染色步骤结束之后把涂片架在纸巾上放置几秒，不使用时将染液保存于棕色瓶中，盖上染色缸，可延长染液的使用寿命。
（8）苏木素的特性相对恒定，很少需要更换，当量不足时可适当补充新鲜染液。
（8）橙黄G6和EA比苏木素损耗得快，应每周更换，或当细胞出现灰色、模糊或对比不鲜明时应更换。
（10）水洗液应该在每次使用后更换。
（11）乙醇应经常使用比重计测量浓度，并每周更换一次，以代替过滤。细胞浆染色后的乙醇漂洗液应每使用一轮后更换。无水乙醇应每周更换一次，可加入Silica‐Gel片剂，以保持无水乙醇的无水。
（12）二甲苯应该在颜色变浅时更换，含水的二甲苯会呈乳白色。无水乙醇中加入Silica‐Gel片剂可降低二甲苯被水污染的程度，这种片剂也可加入二甲苯中，吸收二甲苯中的水分。
（13）有人使用50%，70%，80%，85%乙醇梯度水化以减少细胞的破坏，但Gill使用一步法替代水化，细胞破坏未见增加。
（14）污染控制：苏木素、EA、橙黄G6应该每天至少过滤一次，尤其是在对含癌细胞的涂片进行染色后。妇科标本与非妇科标本应分别染色。为避免交叉污染，建议将富含癌细胞的，以及公认的易于脱落的细胞涂片单独染色。一旦发生了交叉污染，所有的染料和溶液必须全部过滤或丢弃。
（二）H.E染色法
常规H.E染色中苏木素染液的pH值约为7，此时细胞核的化学成分电离产生H＋，所以被阳离子型的碱性染料剂所着色。伊红染液为弱酸性，细胞的化学成分从溶液中获取H＋而成为带正电荷的阳离子，因此与阴离子型的酸性染色剂（伊红）相结合，染成红色，这就是H.E染色分别显示胞核和胞浆的机制。H.E染色主要适用于针吸细胞学涂片，也适用于浆膜腔积液离心涂片以及含黏液较多和细胞丰富的痰涂片。特点是染色效果稳定，细胞核与细胞质对比鲜明，核的结构清晰，方便与组织学切片对照。尤其是随着近年来细胞蜡块（CellBlock）制作技术的发展（具体制作CB的方法参见针吸细胞病理学章节），H.E染色在细胞病理学检查中的作用越来越重要。不过需要指出的是：H.E染色与巴氏染色相比较其色彩单调，不利于上皮细胞成熟度分析，尤其对HPV感染后的特异性着色表现较差，故不推荐在巴氏涂片中使用该染色法。
1.试剂配制
（1）苏木素染液、盐酸‐乙醇液和稀碳酸锂液。
（2）伊红：伊红16g、重铬酸钾8g、苦味酸（饱和水溶液）160ml、85%乙醇160ml、蒸馏水1280ml，将伊红和重铬酸钾溶解于水中，再加入苦味酸和乙醇。
2.染色步骤
（1）将已固定的涂片蒸馏水洗15min。
（2）Harris苏木素1～2min，取出后流水漂洗干净，直到除去多余的染色剂，大约1min。
（3）0.5%盐酸乙醇浸泡2～3次，或直到涂片变为红色，然后流水冲洗30s。
（4）稀碳酸锂溶液蓝化1min，涂片变蓝色，流水漂洗干净，约15min。
（5）50%乙醇浸泡15min。
（6）伊红大约20s，流水冲洗直到除去多余的染色，大约15min。
（7）脱水、透明、封固。
3.染色结果。细胞核呈深蓝色，胞质呈淡玫瑰红色，红细胞呈淡红色。
4.注意事项
（1）染色时应保持各试剂和染液的清洁和纯净。染液中如有沉淀或碎渣应及时过滤，苏木素染液如表面有金黄色结晶应在用前刮去。
（2）苏木素染色时间应根据染液的新旧、染液对细胞着色力的强弱和室温条件灵活掌握。新配染液，首次染色时应镜下观察染色效果。
（3）盐酸分化的掌握是染色成败的关键。如分化不当，导致细胞着色不均。以肉眼观察颜色呈鲜紫红色为好。
（4）蓝化要充分。为防止对伊红液的拒染，应流水充分漂洗或用自来水加温蓝化。
（5）伊红着色要适中，不宜过深或过浅，以致核浆模糊不清。
（6）染色后，乙醇脱水要充分。若涂片滴入二甲苯液出现混浊或云雾状，系脱水未尽，应退回重新脱水。
（7）封片时，冬天要注意口鼻呼出的热气不要接触到载玻片，同样在潮湿的季节，封固动作必须迅速，以避免空气中的水分进入封固剂，影响镜检和涂片久存。
（8）近年来，H.E全自动染色机的应用渐广。应当指出使用无需分化的进行性苏木素染液更为适宜，比如Mayer’s苏木素等。
（三）改良May‐Grǔnwald‐Giemsa（MGG）染色法
中性染色剂即酸性染色剂和碱性染色剂的复合物，又可称为复合染料，是由碱性染料（色碱的盐）和酸性染料（色酸的盐）配制而成。MGG染液由迈‐格氏（May‐Grǔnwald）染料（化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，即伊红美蓝）及姬姆萨氏（Giemsa）染料两种成分混合配制而成。
前者对胞浆着色较好，后者对胞核着色较好，两者合用兼有两种染色的优点，又省去了原法染液分别配制、分别染色之麻烦。适用于胸腹水、尿液、乳头溢液等空气干燥细胞学涂片及细针穿刺的细胞涂片染色，具有简单、省时，并能有效地显示胞浆、胞核的微细结构及细胞内外某些化学物质等特点。若配合常规H.E染色，对某些病变的诊断常能起到决定性的作用，尤其在造血系统的细胞涂片和恶性淋巴瘤涂片中的应用。
1.试剂配制
（1）May‐Grǔnwald试剂：May‐Grǔnwald原液（可保存2星期）。
伊红‐亚甲蓝1.0g纯甲醇100ml
May‐Grǔnwald工作液：
May‐Grǔnwald原液40ml、纯甲醇20ml。
（2）Giemsa液。
Giemsa原液：
天青Ⅱ‐伊红0.6g、天青Ⅱ（37℃孵育3h）0.16g、甘油50ml、纯甲醇100ml。
Giemsa工作液：
Giemsa原液10ml、蒸馏水80ml。
2.染色步骤
（1）May‐Grǔnwald工作液5min。
（2）流水冲洗1min。
（3）Giemsa工作液15min。
（4）流水冲洗1～2min。
（5）空气干燥，不用封片。
3.染色结果。细胞核呈蓝色，胞浆粉红至玫瑰色，细菌蓝色。
4.注意事项
（1）有报道将自然干燥的细胞涂片滴加数滴甲醇预固定。甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料的吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。
（2）染色时间常与染液用量及室温有关，室温高染液用量多，时间短，几分钟即可染完。
一般用2～3滴染液加1～2倍缓冲液稀释，染色20～30min即可。涂片中多黏液及脂肪时，应延长染色时间。
（3）宜镜下观察控制染色时间，以取得最佳效果。MGG染色过深时，可滴几滴甲醇并将涂片稍作倾斜、晃动片刻，再用自来水轻轻冲洗，即能达到染色变浅的目的，且减轻背景颜色，观片更清晰。染色过浅时，重新染色并延长时间即可。
（4）因某些原因未经酒精固定就已干燥了的较薄细胞涂片，不适宜做H.E染色，如改做MGG染色，则是很好的补救办法，有助于诊断。
（四）姬姆萨染色法
姬姆萨（Giemsa）法染色液是天青色素、伊红、次甲蓝的混合液。姬姆萨染色使细胞核着色较好，结构显示较清晰，并能较好的显示胞浆的嗜碱性程度，特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰，色泽纯正。最适于血液涂片，用以染血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
