（2）FRET（fluorescent resonance energy transfer）探针。两条线性探针，一条探针标记在3′端，而另一条探针标记在5′端，探针序列选择性杂交后，两条探针能首尾相近（相距1～5个核苷酸）。当光源激活3′端荧光素时，随之通过荧光共振能量传递（FRET）激发5′端荧光发光，显示杂交成功，即时收集信号。
（3）信标探针。探针呈短柄圆环状，柄端分别标记荧光素和淬灭剂，短柄是由5～6对互补序列组成的杂交体，因而探针在游离状态下，荧光素与淬灭剂相距很近，而不显示荧光。
一旦探针与靶基因发生杂交反应，圆环展开后，荧光素与淬灭剂分离，荧光素激活而发光，被杂交上的探针数量可通过荧光强度而定量。这种短柄圆环型探针还具备独特的功能，可用于检测靶基因的突变。当靶基因发生点突变，此时短柄圆环式探针不能与突变的靶基因完全互补，不稳定的杂交使探针再次游离，因而不产生可测到的荧光信号，这类实验设计必须具备阳性对照及内参照，以剔除假阴性。
即时荧光PCR是一种一管操作抗污染的PCR技术，无需开盖检测。在靶基因扩增过程中，即时记录扩增增长进程，使极低拷贝的靶基因检测成功，并有定量功能。即时荧光PCR是检测微生物病原体的最适合选择。检测结核分枝杆菌，其灵敏度为1～10个菌／ml，可以从常规检测不出病原的结节病病变中，检测到结核分枝杆菌的存在。把传统的培养方法改变成即时荧光PCR，将6周检测时间缩短成2～4h以内。
即时荧光PCR用于病原鉴定尤具特异性，以严重急性呼吸综合征（SARS）为例，做到冠状病毒不同类型和高度变异的鉴定，因而可分清通常不致病的与严重损害人体的各自病原基因型，达到识别出严重致病的有害病原。HBV、HCV和HIV的即时荧光定量PCR检测，其结果指导着临床病情的动态观察和监视，从而把握治疗反应。HIV在血液中的病毒数量，决定了感染是否会出现母婴传递，因此降低了HIV孕妇中HIV的荷载量，可有效控制这种疾病的传播。
把即时荧光PCR用于检测肿瘤细胞特定标志物表达，可从数量上区别它们的表达水平，因此是研究生物标志物表达水平的有力工具。最能显示即时荧光PCR的应用价值，莫过于在监控各类白血病特别是慢性髓系白血病诊断和治疗反应上。以慢性髓系白血病为例，慢性髓系白血病的疾病发生，乃是8号染色体与22号染色体的相互易位t（8；22）（q34；q11），出现比原22号短的标志性染色体即Ph染色体（Philadelphia chromosome）。随后发现这种易位产生BCR‐ABL融合基因，并表达P210kD异常蛋白。细胞遗传学Ph＋白细胞和即时定量RT‐PCR检测，除了可诊断疾病外，更可检测治疗过程中血液和（或）骨髓内残留的白血病细胞。临床的慢性髓系白血病治疗缓解标准分为血液学缓解、细胞遗传学缓解和分子学缓解。其中细胞遗传性缓解（骨髓Ph＋细胞≤35%）和（或）分子学缓解（定量RT‐PCR检测BCR‐ABLmRNA结果下降3个对数级），患者生存期会明显延长。在这里，定量RTPCR检测结果是重要指征。
四、DNA测序
DNA测序由手工操作过渡到自动化，为它的应用开拓了广阔的应用前景。感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤性疾病都有赖于DNA测序的技术支持和信息提供，提高对疾病的认识水平。
新一代测序技术的核心思想是边合成（或连接）边测序（sequencing by synthesis or ligation，SBS&SbL）。即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。
在Sanger等（1877年）测序法的基础上，通过技术创新，将4种不同的dNTP标记上不同的荧光，利用DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就释放出不同的荧光，根据捕获荧光信号，并转化为测序峰值，从而获得待测片段的序列信息。目前商业化应用的新一代测序仪Solexa平台就是根据这一原理设计制造的。技术的不断进步，使得单分子测序技术也从梦想逐步走向了现实，最近报道的HeliScope Sequencer就是其中的典型代表。
Whiteley等提出了利用连接酶进行测序的方法，经20多年的改进，目前，利用连接酶进行边连接边测序的高通量测序平台已经成熟，其代表就是商业化应用的新一代测序仪SOLiDSequencer。该技术的基本原理是利用DNA连接酶在连接过程中读取序列。每一轮测序反应中，加入通用引物和半简并引物，通过连接酶将半简并引物连接到新合成的DNA互补链上，通过鉴别加入的半简并引物来确认互补链上某一位置的DNA序列。
Nyrén和Lundin（1885年）所报道的焦磷酸测序法（pyrosequencing），通过不断的改进以454公司开发的测序仪为代表的测序平台，在多个研究领域取得了巨大成功，使得这一技术平台在新一代测序技术领域中占据着举足轻重的地位。焦磷酸测序的基本原理是由DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶这4种酶及其底物5＇‐磷酰硫酸和荧光素组成的反应体系共孵育，在4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与待测模板配对，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段就可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。释放出的焦磷酸基团经硫酸化酶催化形成等摩尔数的ATP，生成的ATP和荧光素酶共同催化底物荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素发出的可见光强度与生成的ATP量成正比，光信号经CCD摄像机捕获，并通过计算机软件转化为一个峰值，经焦磷酸基团和ATP获得的每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。与此同时，ATP在双磷酸酶的催化下被游离的dNTP降解，光信号被淬灭，并再生反应体系，然后加入下一种dNTP，继续互补DNA链的合成，进入下一个循环。
有代表性的新一代商业化测序平台：Roche（454）GSFLX sequencer，Illumina genome analyzer，Applied Biosystems SOLiD sequencer，HeliScope Sequencer等可参阅相关公司网站。新一代测序技术及其商业化平台推出后，其低廉的价格、高通量的数据、简易的样品前处理过程，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期。可以预见，不久的将来，基因组测序或重测序以及基因组水平的数据分析研究将成为普通实验室的一项日常工作，分子生物学研究进入了一个崭新的时代。
在临床和病理实践中，通过DNA测序，特别针对原发性基因异常，有重要诊断和治疗指导价值。胃肠道间质瘤采用DNA测序技术基因分型，可区分为cKit突变型、PDGFRA突变型和野生型。可协助解决组织学、免疫组织化学鉴别诊断不确定的病例，更重要的是通过DNA测序选择有效的靶向治疗药物。K‐ras基因是公认的癌基因，参与EGFR信号传导过程。临床研究表明，K‐ras突变型人群对EGFR单克隆抗体药物的疗效显着低于野生型人群。对K‐ras基因的突变检测，可作为预测抗EGFR药物个体疗效的一项重要参考指标。
临床靶向治疗的新发展，推动病理工作建立新技术、新方法，并提出更严格的标准化要求。
五、流式细胞（flow cytometry，FCM）
FCM是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析和分选的一种新技术，它综合利用了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，可以对细胞大小、DNA含量、细胞表面抗原表达等进行定量、快速、多参数相关的检测。根据人体正常细胞DNA为二倍体，而恶性肿瘤细胞DNA常为非整倍体的特点，流式细胞术已经应用于细胞病理学临床实践中，例如良恶性胸腹水鉴别诊断，宫颈液基细胞学检查之后剩余细胞的DNA倍体分析以进一步确诊癌前病变或恶性肿瘤，甲状腺、乳腺细针穿刺获取细胞的DNA倍体分析以鉴别良恶性肿瘤等等。另外，流式细胞术还广泛用于淋巴瘤的诊断和分型。
六、细胞学自动阅片系统
在对传统制片技术进行革新的同时，PAPNET和Autopap，自动阅片系统也先后开发并走向市场。PAPNET系统是“脑神经网络模拟系统”，该系统对传统的巴氏宫颈涂片在显微镜下进行电脑扫描，最后筛选出128个最明显的“病变”细胞并自动照相、刻录到光盘上。
细胞病理医生在高分辨率的电视屏幕前阅片，如发现可疑细胞，可借助自动定位系统，在原涂片上找到该细胞，在显微镜下核实诊断。有研究显示，对于原位癌和浸润癌，PAPNET的检出率明显高于常规法，而且其准确性也均高于常规法。另外，1885年美国FDA批准把PAPNET系统用于宫颈涂片的质量控制工作中，主要对人工筛查阴性的宫颈涂片进行复查。有研究显示，PAPNET系统在质控复查阴性涂片中的敏感性相当于专业细胞学人员的人工复查。
Autopap是继PAPNET之后推出的更先进的自动阅片系统，既可以用于对传统巴氏涂片的初筛，也可以用于对液基薄层制片的初筛。AutoPap自动扫描系统通过其预先设计的标准，对宫颈涂片的细胞形态进行分级打分，确认并记录最“不正常”的15个视野，然后由专业细胞学人员检查这15个标记的视野，该系统大大提高了工作效率。有研究表明，在确诊未确定意义的非典型鳞状细胞和低度鳞状上皮内病变时，AutoPap优于常规法。
七、全自动细胞DNA定量分析系统
全自动细胞DNA定量分析系统结合了显微分光光度术与图像处理分析技术，能对细胞核的结构和DNA含量进行定量分析。根据人正常细胞是二倍体，恶性肿瘤细胞常为异倍体细胞的特点，该系统已经用于痰涂片筛查肺癌细胞、良恶性胸腹水鉴别诊断、宫颈细胞学涂片的筛查等。与流式细胞仪的DNA定量分析技术相比，它有如下优点：①不需要将取材细胞制成单细胞悬液，避免了因为悬液中常包含多种其他细胞成分，如间质细胞、血管内皮及白细胞等，而造成假阴性结果。②细胞数量很少也可检测。③能在显微镜下直观地对每一个细胞做出逐个测量，在DNA倍体测量的同时能对其形态参数，如核面积、核浆比等做出准确的定量测量。该系统检测客观、准确、快速，避免了人为的疏漏、经验不足和只根据单一的细胞形态改变来诊断等不足之处，提高了诊断的准确性和筛查的阳性率，降低了宫颈癌前病变的漏诊率和误诊率。
