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第27章 重组细胞因子(1)

知识目标

掌握重组药物的研发技术路线及一般生产过程;

掌握获得真核基因的cDNA文库法及高效表达载体的构建;

掌握重组人白细胞介素的生产工艺;

掌握几种重要重组药物及其临床应用;

了解细胞因子及基因工程药物的发展趋势。

能力目标

具备从事基因工程药物生产及研发能力;

培养学生的自学能力、分析问题能力;

培养学生的团结协作精神。

细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。它们在细胞之间传递信息,调节细胞的生理过程,提高机体的免疫力,防止肿瘤发生,在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。

细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义,它有助于阐明分子水平的免疫调节机理,有助于疾病的预防、诊断和治疗,多种重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等,并收到良好疗效。

由于大多数细胞因子具有高度的种属特异性,所以最初临床使用的细胞因子一般是从体外培养的免疫细胞或肿瘤细胞株的培养液上清中或血液中直接提取,不但产率低、纯度很难保证,而且价格昂贵。此外,一些细胞因子含量极微,难以提纯到足够数量和纯度的样品,限制了其结构和功能的研究。

【知识拓展】

传统方法生产干扰素存在的问题

(1)成本高

芬兰Cantell实验室在1979年从45000L血中才生产了200mg干扰素,由此估计1kg干扰素价值约220亿~440亿美元。1992年,西格玛公司的标价是IFN‐α182.2美元/100万U,用IFN‐α治疗一位肝炎病人需要3万美元。

(2)组分多

一种细胞在诱生剂作用下产生的为多种干扰素的混合物。如白细胞产生的99%为IFN‐α,1%为IFN‐β。Namalva细胞产生的80%为IFN‐α,20%为IFN‐β。

(3)纯度低,活性低

用传统方法生产的干扰素纯度最高也只有1%,活性在10000~50000U/mg,而一般认为临床人干扰素的纯度不得低于106U/mg蛋白。

进入20世纪80年代后,分子生物学技术的发展为细胞因子的研究提供了新的契机。

利用cDNA克隆技术,一个又一个的细胞因子结构被阐明;利用外源基因表达技术,可获得大量的重组细胞因子纯品,使细胞因子的功能研究和治疗各种疾病的应用研究得以进行。

目前,细胞因子研究的成果巨大,分子克隆成功阐述了数百种细胞因子的结构和功能,可利用大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等工程细胞大规模生产的重组细胞因子有上百种,其中数十种细胞因子或其抑制剂已被批准作为药物正式上市,另有多种处于临床研究阶段。可以说,细胞因子药物的研究与开发是医药生物技术领域最为成功和引人注目的领域。

13.1研制重组细胞因子的技术路线

目前研制基因工程药物(以多肽或蛋白质为例),主要有以下两条技术路线:一种是,首先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质或多肽(以下统称蛋白质),然后克隆出编码这种蛋白质的基因,组入合适的表达载体,导入能高效表达这种蛋白质的受体细胞,在受体细胞不断繁殖过程中,大规模表达生产这种蛋白质药物。基本技术路线是:获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因→组入表达载体→受体细胞高效表达→动物试验→临床试验→申报新药证书。此技术路线的目的明确,而缺点是发现新药的几率低,一般只有那些能在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。

另外一种是利用反向生物学原理,沿着从基因序列到蛋白质到功能到药物的途径研制新药(基因组药物),即先获得某种cDNA,组入合适的表达载体,导入合适的受体细胞,提取这种cDNA表达的蛋白质,分析其生物学功能,确定药用价值。基本技术路线是:基因组→未知功能的人类基因全长cDNA群→组入表达载体→受体细胞瞬间表达→功能初筛→功能验证→重组蛋白表达体内外药效分析→临床前研究→临床验证→申报新药证书。此技术路线的优势是建立在庞大人类基因组资源基础上的,具有巨大开发潜力,缩短新药开发时间,可大规模增加新药的数量。据估计,人类基因组约有3万~4万个基因,其中至少有5%,即1500~2000个基因编码的蛋白质可能具有药物开发价值,而目前开发的人类基因重组药物已上市的只有50余种,进入临床实验的约300种,采用此技术路线最终可能导致几千个新药的问世。

13.2重组细胞因子生产的基本过程

基因工程药物的生产是一项十分复杂的系统工程,可分为上游和下游两个阶段。上游阶段是研究开发必不可少的基础,它主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。下游阶段是从工程菌(细胞)的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。

上游阶段的工作主要在实验室内完成。基因工程药物的生产必须首先获得目的基因。

目的基因获得后,最重要的就是使目的基因表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能,其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。将目的基因与表达载体重组,转入合适的表达系统,获得稳定高效表达的基因工程菌(细胞)。

下游阶段是将实验室成果产业化、商品化,它主要包括工程菌大规模发酵、高纯度产品的分离纯化。工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵,需要对影响目的基因表达的因素进行分析,对各种影响因素进行优化,建立适合于目的基因高效表达的发酵工艺,以便获得较高产量的目的产物。为了获得合格的目的产物,必须建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。

13.3目的基因的获得

来源于真核细胞的目的基因不能直接进行分离。真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中的很小一部分,大约为其10~10,即使多拷贝基因也只有其10,因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外,真核基因内一般都有内含子,如果以原核细胞作为表达系统,即使分离出真核基因,由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统,真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA,因此不能直接克隆真核基因。

目前克隆真核基因常用的方法有cDNA文库法和化学合成法两种。

13.3.1cDNA文库法

以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。对真核细胞来说,从cDNA文库中获得的是经过剪接、去除了内含子的cDNA。通过cDNA文库法获得目的基因主要包括以下几个步骤:

13.3.1.1mRNA的纯化

细胞内含有3种以上的RNA,mRNA占细胞内RNA总量的2%~5%,相对分子质量大小很不一致,由几百到几千个核苷酸组成。在真核细胞中mRNA的3′末端常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端,长达20~250个腺苷酸,足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸OligodT‐纤维素上,从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3′末端含有polyA的特点,RNA流经寡聚dT纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mR‐NA被特异地结合在柱上;当逐渐降低盐的浓度洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水洗脱的情况下,mRNA被洗脱下来;经过两次寡聚dT纤维素柱后,就可得到较高纯度的mRNA。

13.3.1.2cDNA的合成

一般mRNA都带有3′‐polyA,所以可用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,进行cDNA链的合成。用碱解或RnaseH酶解的方法除去cDNA‐mRNA杂交链中的mRNA链,然后以cDNA第一链为模板合成第二链。

13.3.1.3cDNA克隆

用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体DNA。根据重组后插入的cDNA是否能够经转录和翻译表达目的蛋白质,又将载体分为表达型载体和非表达型载体。PUC及λgt11为表达型载体,在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序;而pBR322及λgt10为非表达型载体。

在cDNA克隆操作中应根据不同的需要选择适当的载体。cDNA插入片段小于10kb,可选用质粒载体,如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选。

【知识拓展】

噬菌体载体λgt10和λgt11

R.Young和R.Davis设计的λgt10和λgt11是噬菌体克隆载体,可用于构建cDNA文库。它们一方面有较高的克隆效率,只需少量DNA便能十分有效地产生许多克隆,如1ngcDNA可产生5000个克隆;另一方面,又可容纳较大相对分子质量的外源DNA片段。由于筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更方便,因此这些载体在构建文库时优于质粒载体pBR322。

cDNA插入到λgt10中可使噬菌体阻遏物基因(cI)失活。当用大肠杆菌c600的突变型hflA(高频溶源性)作为宿主时,只有携带cDNA插入片段的噬菌体可形成噬菌斑。

λgt11是表达型载体。λgt11中的cDNA插入片段是克隆在β半乳糖苷酶基因编码区的羧基端,在含IPTG和Xgal的平板上,带cDNA插入片段的λgt11可形成清晰的无色噬菌斑,未带cDNA插入片段的λgt11则形成蓝色噬菌斑。

13.3.1.4将重组体导入宿主细胞

目的基因序列与载体连接后,要导入细胞中才能繁殖扩增,再经过筛选,才能获得重组DNA分子克隆。不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖,导入细胞的方法也不相同。将由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变的称为转化;噬菌体进入宿主细菌中繁殖的称为感染;重组的噬菌体DNA也可像质粒DNA的方式进入宿主菌,即宿主菌先经过CaCl2、电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA,进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖,这种方式称为转染。重组DNA进入宿主细胞也常用转染方式。

将重组DNA导入宿主细胞常用的方法有:磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等。

13.3.1.5重组体筛选

【知识拓展】

cDNA片段与载体的连接方法

(1)加同聚尾连接

用3′末端脱氧核苷酸转移酶催化,使载体与cDNA的3′末端带上互补的同型多聚体序列,如载体加上polyC的尾巴,则cDNA加上polyG的尾巴,这两种黏性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化,借助同型多聚体的退火作用形成重组分子,最后用T4DNA连接酶封口。

(2)加人工接头连接

用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工接头是指由人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后,用该种限制酶酶切就可得到黏性末端,从而能够与载体连接;cDNA中可能也带有同样的限制酶切点,为了保护cDNA不受限制酶破坏,保证其完整,可以在加接头前先用甲基化酶修饰这些限制酶切点。

目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的,因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA,一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆,所以筛选是基因克隆的重要步骤。

一般根据重组体的表型进行筛选,主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。如载体含有两个抗药性基因,重组体的某一抗药性(如抗氨苄青霉素、抗四环素、抗卡那霉素等)消失;体外包装的λ噬菌体,感染感受态大肠杆菌可形成噬菌斑;载体含有lacZ′(β‐半乳糖苷酶N端146氨基酸编码序列)的可采用蓝白筛选法。

筛选的所有重组体构成了一个cDNA文库,理想状态下,含有相应组织细胞的所有cDNA片段。要获得某一特定基因的cDNA,需从cDNA文库分离特异cDNA克隆。也可随机从cDNA文库挑选克隆,对其表达产物的功能进行研究,开发新药。

13.3.1.6目的cDNA克隆的分离和鉴定

从cDNA文库分离特异cDNA克隆,主要采用下列两种方法:①核酸探针杂交法。用层析和高分辨率电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质,根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果,人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针,从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。

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