（2）阳性孔筛选
将融合的细胞进行培养后取上清液用ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。将某一孔阳性细胞再进行克隆化至一个96孔板，用ELISA法检测，阳性率如为100％，挑选抗体高分泌性细胞再克隆化至一个96孔板，用ELISA法检测，如此反复，直到3次阳性率100％，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。
10.2.2单克隆抗体的制备
10.2.2.1免疫动物
选择纯系健康8周龄的BALB/C小鼠，采用皮下注射、腹腔注射等多种免疫方式，将细胞或微生物抗原直接注射小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的弗氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。一般包括初次免疫、加强免疫、冲击免疫三个过程。此外，也可采用脾内直接免疫法。
10.2.2.2脾细胞的制备
脱臼处死免疫小鼠，无菌操作取脾脏，培养液清洗后，放在盛10ml培养液平皿中，用注射针头扎孔，内管挤压（剪碎）脾脏，得单细胞悬液，计数后将细胞液置于离心管中备用。
10.2.2.3骨髓瘤细胞的制备
在融合前的两周，将冻存的BALB/C小鼠骨髓瘤细胞复苏，经过含8‐AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8‐AG的培养基中存活），再用RPMI‐1640培养液培养健壮，保证融合时其处于对数生长期，收集计数。
10.2.2.4细胞融合
融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。
将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以8~10∶1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心10min，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60s内逐滴加入50％的PEG0.5ml，随后静置90s，再于5min内，边振摇边逐滴加入5~10ml不含血清的培养液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，1000rpm离心10min。
10.2.2.5分装培养
离心后的混合细胞中加入含20％小牛血清的HAT培养液，按每孔0.1ml加入96孔培养板中，同时再加入0.1ml的饲养细胞悬液，加盖后置5％CO2培养箱37℃培养。次日检查，若正常，换液（HAT培养液），以后隔日一换。未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞5~6天后逐渐死亡。
10.2.2.6阳性克隆的筛选
阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确，而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
10.2.2.7杂交瘤细胞的克隆
检测到有抗体产生后尽早进行克隆化，目的是为了获得单一细胞系的群体。初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向，一般情况下，需要作三次以反复克隆化后可获得稳定的单克隆抗体细胞株。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法
在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂、效率低，一般实验室没有该设备，故不常用。
（2）有限稀释法
将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增殖后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2~3次的亚克隆。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。
10.2.2.8细胞的冻存与复苏
细胞冻存与复苏的总原则是缓慢冷冻和快速复苏，反之则容易导致细胞内的冰晶形成。细胞株用5％~10％甘油或二甲基亚砜（DMSO）为保护剂，并含有高浓度（40％~60％）的小牛血清，在液氮中保存。细胞悬液以1~3℃/min的速度降温，15~20min后放入液氮罐的气室中，以100℃/min的速度降温至—100~—150℃，3~4h后快速放入液氮中。
复苏时，将存有冷冻细胞的试管直接放入37~40℃的水浴中迅速解冻，然后在解冻的试管中快速加10ml的新鲜培养液，离心去除冷冻剂，再加含小牛血清的新鲜培养液进行培养。
10.2.2.9单克隆抗体的生产
大量生产单克隆抗体的方法可分为体内诱生法和体外培养法两大类，目前仍以体内诱生法为主。
（1）体内诱生法
先给小鼠腹腔注射降植烷造成小鼠无菌性腹膜炎，7~14d后将1×10个杂交瘤细胞悬浮于0.5ml生理盐水中，并注入小鼠腹腔，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。
在接种后的2周左右的时间内，经穿刺可得到5~10ml的腹水，内含单克隆抗体的浓度5~20mg/ml。
（2）体外培养法
将杂交瘤细胞置于培养瓶中加上适当的培养基进行培养，培养液中可分离单克隆抗体。
10.2.2.10 单克隆抗体的纯化与保存
（1）单克隆抗体的纯化
小鼠腹水在4℃下，2000×g离心20min，去除纤维蛋白、不溶性颗粒及表面的脂肪层。
然后向上清中滴加等体积的pH7~8的饱和硫酸铵溶液，进行沉淀；或用DEAE‐SepharoseCL6B离子交换柱进行层析，收集第一峰。亲和层析法虽然获得的产品纯度高，但成本高、效率低，比较少用。
此外，还有凝胶过滤法和ProteinA‐SepharoseCL4B层析法，前者主要用于IgM类单克隆抗体的纯化，后者适用于IgG1和IgM类单克隆抗体的纯化。
（2）保存
纯化后的单克隆抗体最好保存在0.3MNaCl溶液含0.04％NaN3、0.03M6‐氨基己酸中。在此环境中，4℃下可保存数月。有条件时，可在上述环境中冷冻干燥保存。
10.2.3单克隆抗体的应用
单克隆抗体问世以来，由于其独有的特征已迅速应用于很多医学领域，主要表现在以下几个方面：
10.2.3.1医学诊断试剂
作为检验试剂，单克隆抗体的抗原抗体反应特异性强，交叉反应少，结果可信度更大，便于质量控制和试剂盒的标准化、规范化。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：①病原微生物抗原、抗体的检测；诊断各种病原体，对HIV病毒、乙肝病毒、疱疹病毒等进行早期诊断。②肿瘤抗原的检测；诊断肿瘤，寻找各种恶性肿瘤细胞，甚至定位或分型，进而采取治疗措施。③免疫细胞及其亚群的检测。
④激素测定。⑤细胞因子的测定。
10.2.3.2蛋白质的提纯
单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。
10.2.3.3肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。
单克隆抗体属于鼠源性，鼠源单克隆抗体如作为生物制剂应用于人体，会因异性蛋白引起的过敏反应危及生命。经典的杂交瘤技术制备的单克隆抗体需经过改型增加其人源化成分才能用于人体。
10.2.4单克隆抗体的优缺点
10.2.4.1单克隆抗体的优点
单克隆抗体具有以下几个方面的优点：①高特异性，由于单克隆抗体只针对一个抗原决定簇，而一个抗原决定簇又很小，一般只有4~7个氨基酸，故单克隆抗体发生交叉反应的机会很少，即其特异性高；②高度的均一性和可重复性，只要长期保持杂交瘤细胞的稳定性，不发生突变，就可以长期获得同质的单克隆抗体；③可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体；④由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等；⑤由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
10.2.4.2单克隆抗体的局限性
单克隆抗体也有很大的局限性：①由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成；②单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体；③制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高；④目前单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。此外，单克隆抗体分子量大，难以被细胞吸收。因此，制备人—人单克隆抗体、人源化抗体和小分子抗体更为重要。
10.3基因工程抗体
自1975年单克隆抗体杂交瘤问世以来。单克隆抗体在医学中被广泛应用于疾病的诊断治疗。但目前绝大多数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时产生抗原鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。因此，理想的临床应用单克隆抗体应是人源的，但人—人杂交瘤技术目前尚未突破，即使研制成功，也还存在人—人杂交瘤细胞体外传代不稳定、抗体亲和力低及产量不高等问题。目前较好的解决办法是研制基因工程抗体，以代替鼠源单克隆抗体用于临床。
基因工程抗体兴起于20世纪80年代早期。这一技术是将对抗体基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合成且导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。
基因工程抗体包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、单区抗体及抗体库等，其中嵌合抗体研究的较多，也较成熟。单链抗体及单区抗体虽具有结构简单、分子小等优点，但其临床应用的前景尚待证实。
10.3.1人源化抗体
鼠单克隆抗体的人源化，就是为克服鼠源McAb的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反应。进行鼠单克隆抗体的人源化有两个基本的原则：保持或提高抗体的亲和力和特异性，大大降低或基本消除抗体的免疫原性。人源化有多种方案都必须遵循这两个原则，尤其不能丧失抗体特异结合的能力。
