1610年末，伽利略收到罗马天主教学院数学教授克拉维斯神父寄给他的信，信中说他也观察到了4颗木星卫星。神父热情邀请伽利略访问罗马，还表示他的到来将会受到罗马各界的热烈欢迎。伽利略接受了邀请，因为他也早有一个想法，想寻找机会结识罗马的科学界及宗教界的学者们，说服他们允许自己尽快地把发现的关于哥白尼学说的证据公开发表。伽利略原于12月份访问罗马。不料，由于这一段时间以来，他坚持在夜晚进行天文观测，受了风寒，关节炎发作了。严重时甚至卧床不起。这样访问罗马的计划不得不推迟。直到第二年3月病愈后才踏上了去罗马之路。
伽利略的到来，轰动了罗马城。他受到极其隆重的、贵宾般的礼遇，罗马的贵族、著名学者、教会高级官员都争相邀请他为座上宾。教皇保罗五世也亲自接见了他。
在罗马与伽利略共处时间最长的是贝拉明红衣主教。贝拉明大主教是罗马天主教学院的院长，具有很高的声望和权力。伽利略同他一起讨论了科学问题，二人有许多共同语言。他对伽利略十分赞赏，然而，伽利略在天文学上的新发现却使贝拉明主教感到不安。因为多少世纪以来，教会只接受亚里士多德理论，崇奉托勒密学说，即地球居中心不动，太阳绕地球运行。而伽利略的发现和结论，显然对教会不利，甚至会动摇人们对宗教的信仰。因此，贝拉明力劝伽利略在涉及哥白尼学说问题上要谨慎从事。他建议把一切哥白尼的学说视为未经证实的理论，不宜奉为真理对待。伽利略深知这位大主教在欧洲天主教界的权势和地位，必须征得他的同意才能使自己的发现和理论得到官方承认，才能公开发表。尽管心里不服气，但表面上还是表示接受他的意见。
伽利略得到罗马兰塞学院的邀请，参加了他们的会议，并接受邀请光荣地成为了兰塞学院的一名院士。兰塞学院是一个由当时第一流的科学家组成的学术团体。创始人塞西伯爵是一位学识渊博的青年贵族，素爱与学者为伍。这个学术团体的活动主要是研讨数学、天文学等学术问题，并负责集资、组织公共演讲，还可帮助出版科学家的学术著作。因此在欧洲当时诸多学术团体中有极高的声望。加入这个团体是一个“特殊的荣誉”。从此以后，伽利略在签名时，可以在他的名字后面写上一个“L”字母，表示他是兰塞学院的院士。兰塞学院的院士们向伽利略表示，可以运用他们的影响和资金去传播他的科学成就，帮助他出版他的书籍。
这次罗马之行，伽利略结识了许多科学界及宗教界的朋友，这为他日后许多著作的出版创造了有利条件。
回到佛罗伦萨后，伽利略曾一度把思路转向浮动物体研究。他很快完成一篇论述浮动物体的论文，寄到罗马兰塞学院出版，因为该论文观点上的争议，伽利略与亚里士多德的忠实信徒红衣主教冈扎加结下了怨恨。
伽利略对天象的观测也一直没有放松。这次他将望远镜指向了太阳，发现太阳表面上有暗黑的斑点。这些斑点大小形状各不相同。这一现象引起了他的关注。他把观测到的现象绘在图上，然后继续进行观察。为防止阳光刺眼，又能观察清楚，他在太阳接近地平线或者太阳光被浓雾遮蔽时对太阳进行观测。这也可能是导致他晚年失明的重要原因。观测一段时间后，他发现这些太阳黑子在缓慢移动，在西边缘时，运动很缓慢，而趋于日面中心时，运动速度加快，当移至东边缘时又变慢了。这一现象引起了伽利略的沉思。他认为应该有两种解释，或者是太阳黑子在绕着太阳运动，或者是太阳在绕其自身的轴旋转。伽利略更倾向于后一种可能。他推算出太阳自转一周大约需用28天时间。
当然，伽利略并不是第一个发现太阳黑子的人，但利用望远镜他看到了比前人更清晰的景象。他的卓越贡献是观测到黑子在太阳面上的移动和变化，证明太阳在绕轴自转。
伽利略把自己的观测结果和观点写信告诉了朋友们。
伽利略的《关于太阳黑子的信》1612年由兰塞学院出版，很快传遍科学界和宗教界，引起了人们的普遍关注。亚里士多德的信徒们终于不能忍受，于是群起而攻之。一位著名的神父公开在布道时批判伽利略和他的学说，还有人指责伽利略是异端分子。人们风传罗马在调查伽利略的新论，教廷在罗织他的异端罪证。
伽利略心里明白他的发现进一步证实了哥白尼学说，这可能会给他带来麻烦。他深知罗马教廷的厉害，意大利著名科学家布鲁诺为捍卫哥白尼学说，被活活烧死在罗马鲜花广场，人们至今记忆犹新。伽利略感到事态发展下去后果严重。为了探听这些传言的背景，以便澄清和表白，他决定立即去罗马，以求得到罗马方面的理解和支持。科西莫大公也对他深表关切，愿意尽力帮助他。亲笔写信给罗马上层人物，为伽利略辩解。1615年12月，伽利略带着科西莫大公的信再次来到罗马。
这一次，罗马一改旧日的热情。4年前曾争相邀请他的那些贵族和官员不再露面了。只有兰塞学院的塞西伯爵仍然像往日一样盛情接待他。
在罗马的两个月中，伽利略设法拜访了教会和贵族阶层的老朋友。发现他们对自己的态度已经发生了很大的变化，有的对他相当冷淡，有的对他避之唯恐不及，有的对他怀有敌意。连很要好的一些朋友现在也不敢接近他。而他的论敌——亚里士多德的追随者们，则公开指责他的主张违背圣经，暗中收集他的罪证，伺机向罗马教廷提出控告。
塞西伯爵和杜斯干大使都劝伽利略要谨慎，暂时回避关于哥白尼学说的讨论。因为这是他遭到仇视和威胁的主要原因。在这种情况下，伽利略服从了罗马教会的强大压力，向教会表白了他的忠诚。声明他永远是一个虔诚的天主教徒。尽管如此，伽利略还是受到教会法庭的正式警告，不得将哥白尼学说作为绝对事实进行讨论与辩解。伽利略违心地在保证书上签了字。因此，他得到贝拉明主教的证明书，这张证明书上说伽利略是无辜的，可以免受各种形式的惩罚。
1616年3月5日，天主教会决议，宣布哥白尼学说为“异端”，哥白尼的著作《天体运行论》列为禁书，凡是宣传哥白尼学说的出版物一律不许发行。除非对书中的表述方式作某些改动，将其学说作为观点而非事实才可以发表。这对伽利略来说无疑是一次重大的打击。这些禁令迫使伽利略无法继续进行天文学研究，他的一系列研究成果也难以公开。
