元丰二年（1079）三月，苏轼44岁，以祠部员外郎直史馆知湖州军州事。接到命令后，苏轼立即收拾行李，带着家人前往湖州。同去的还有王子立、王子敏，是苏轼的学生；此时二王方年少，曾与苏轼饮酒杏花下，吹洞箫以为乐。离开徐州的那天，吏民们感念他在抗洪中的功劳，割断马橙、拉住马缪舍不得他离去。
苏轼先去了南都，与弟弟苏辙话别。四月过泅州，至高邮，遇见了秦观。秦观上京考试落第后一直在高邮的老家闭门读书，才准备到会稽去走亲戚，刚上路就碰见了要去湖州赴任的苏轼。他们一块儿行走，游览了沿路的风景名胜之地，然后依依不舍地分了手。
四月二十九日，苏轼到达湖州州治吴兴，立即投身于繁忙的政务之中，吴兴“风俗阜安，在东南号为无事”，并且“环城三十里，处处皆佳绝”（《登崛山亭晚入飞英寺》），他闲暇时常与友人或子侄游山玩水，吟诗作赋。王子立、王子敏在苏轼的悉心指导下，学业提高很快。苏轼后来在《子立墓志》中说：“子立、子敏皆从余学于吴兴，学道日进，东南之士称之。”
有个叫陈师锡的人很有才华，曾得到神宗皇帝的称赞，此时在昭庆军掌书记。苏轼很器重陈师锡，常与其谈论文章，并倚以为政。
七月七日，苏轼把家藏的书画拿出来在院中晾晒，其中有一幅画是文与可赠他的《筼筜谷僵竹》，便不由得睹物思人，心里悲伤不已，写了《文与可画筼筜堰竹记》，追记俩人之间交往的情谊，总结了文与可创作经验：“故画竹必先得成竹于胸中，执笔熟视，乃见其所欲画者，急起从之，振笔直遂，以追其所见，以兔起鹊落，少纵则逝矣。”脍炙人口的成语“成竹在胸”即出于此。
苏轼从来相信人都是好人，不提防人，而他的政敌却在暗中算计着他。在他由徐州太守转任湖州知州三个月时，一场精心策划的针对他的诬陷阴谋开始实施了。
这时朝廷因王安石罢相已久，吕惠卿争权被贬，变法派逐渐变质，内部矛盾尖锐，党争变成了排除异己，继任宰相吴充、王硅两人也不合，政局动荡不稳。由于苏轼在诗歌中嘲讽时政，且苏诗传播很快，变法派对苏轼恨之人骨，使他们必欲置苏轼于死地的缘由，却是由一张谢表引起的。
苏轼到湖州任后，立即写了《湖州到任谢表》上奏朝廷，其中一些话颇令当权的人难以忍受，如“法令具存，虽勤何益，”“伏念臣性资顽鄙，知其愚不适时，难以追陪新进。察其老不生事，或能牧养小民。”王安石把那些突然升迁的无能后辈称为“新进”，赋予了这两字以固定的含意。苏轼的这篇谢表与其他告文一块公开发布后，朝野一片哗然，“新进”们坐不住了，便设法给他编织罪名。
先是监察御史何正臣弹幼苏轼《自徐州移守湖州谢表》中的话语含讽刺，“妄尊自大”且“愚弄朝廷”。几天后的七月二日，监察御史舒宜从别人编的《苏子瞻学士钱塘全册》中摘录了些句子，如“赢得儿童语音好，一年强半在城中”，“读书万卷不读律，致君尧舜终无术”，“东海若知明主意，应教斥卤变桑田”等，弹劫苏轼对新法“肆为低毁，无所顾忌”，并印刷四册诗文呈送皇帝。皇帝将这些诗文交中书省勘检。同一天，那个母丧不奔，贪恋权势，被司马光斥为禽兽的御史中71李定，也上表弹幼苏轼，指出他犯有侮慢朝廷，怨谤君王、交通戚里、讥汕时事之罪。皇帝将这些表奏交御史台验勘，李定任检查官。皇帝根据李定等人的报告，决定由御史台官吏、太常博士皇甫遵去湖州逮捕苏轼。
实际上苏轼对北宋王朝是一片愚忠，曾多次上书对新法表示了不同意见，其出发点完全是为了巩固北宋王朝政权。被排挤到地方上以后，对新法执行中出现的一些弊端用诗的形式反映出来，以期引起朝廷的注意，完全出于关心国事的心理。被指控为有罪的诗有几十首，其中有些诗没有任何讥讽诽谤之意，却被别有用心的人穿凿附会而凭空诬陷。其中有首《八月十五日看潮五绝》之四：“吴儿生长押涛渊，冒利轻生不自怜。东海若知明主意，应教斥卤变桑田。”苏轼有感于昊地的人为求“彩物”常冒险赴海弄潮而有溺死现象而写此诗，与新法毫无关系，却被舒宜诬为攻击农田水利法。更有甚者，王硅竟诬告苏诗《咏桧》是反对皇帝的，诗里这样写的：“凛然相对敢相欺，直干凌空未要奇。根到九泉无曲处，世间惟有蛰龙知。”王硅说：“陛下飞龙在天，而轼求之地下蛰龙”，结论是有意谋反，其荒唐程度连宋神宗后来都说：“彼自咏桧，何予联事！”不过，苏轼写了些批评新政的诗，如《山村三首》之三：“老翁七十腰自镰，惭愧春山笋蕨甜。岂是闻韶解忘味，迩来三月食无盐。”这首诗反映了山区百姓吃不到盐的现实状况。当时食盐由官府专卖，小商贩不得经营，边远山区吃不上盐，苏轼曾上书提到过这种情况，请求放宽盐禁、所以该诗远远谈不上诽谤朝廷。
当时苏辙在应天府任判官，其挚友附马都尉王铣得知消息于禁中，便通过王巩告诉了苏辙。苏辙听后大吃一惊，立即托人火速赶赴湖州告诉苏轼，前去宣旨逮捕苏轼的官员因带着儿子同行，恰儿子途中生病耽误半日，苏轼就抢先得知了消息。
苏轼听到朝廷捕他人狱的消息后起先有一阵慌乱和害怕，他不知道自己犯了什么罪，也不知道罪有多重，只知道朝中大臣多为政敌，此去凶多吉少，但他很快就镇定了下来，决定服从命运的安排，于是大略安排了家庭的事情，让大儿子苏迈跟自己进京，以照应自己狱中的生活。当皇甫遵带人来到湖州衙门时，他平静地跟着押解他的人上路了，时间为七月二十八日。当时的情景按苏轼所作《子立墓志》所说“予得罪于吴兴，亲戚故人皆惊散，独两王子不去，送予出郊曰：死生祸福天也，公其如天何。返取予家，致之南都。”又按他写的《上文潞公书》中所说：“某始就逮赴狱，有一子稍长，徒步相随；其余守舍，皆妇女幼稚。至宿州，御史符下，就家取书。州郡望风，遣吏发卒，围船搜取，长幼几怖死。即去，妇女患骂曰：是好着书，书成，何所得而怖我！如此，悉取焚之。”陈师锡在亲朋多畏避不相见的情况下独自与苏轼饮酒话别，回来后又安慰家属。
苏轼在押解途中，猜度到自己此去难以活命，又会连累朋友，当船靠太湖妒香亭下修桨时，很想闭眼跳人湖中了结自己的生命，又转念想到自己一死，弟弟苏辙必不能独生，就打消了自尽的念头。八月十八日抵京，被投人御史台监狱。御史台又称乌台，因汉代御史府内柏树成林，常有无数乌鸦栖息在树上，故名“乌台”。苏轼因写诗人狱，后人称为“乌台诗案”。
苏轼在狱中每天进行一次审讯，八月三十日这天是第十一次审讯，他为了结束这无休止的审讯，就决定认罪，于是在审讯记录上签了“撰作诗文讥讽”等语。李定等人根据对苏轼多篇诗文的审查，两月后拿出案情报告，欲置他于死罪。
苏辙早已来到京城营救哥哥，精心写了一篇《为兄轼下狱上书》呈送给了宋神宗，表示愿意“臣欲乞纳在身官，以赎兄轼”。文章是在苏轼性命交关的时候写的，很是真挚惨痛，说理部分十分委婉，设法为苏轼开脱。先是承认苏轼有错，因累年“上章论事”，“狂猖寡虑”，出判杭州以来，诗中有许多不妥当处。但承认过错却为了开脱过错，所以接下来说上章论事中的不当是“赋性愚直”所致，在外地所作的诗是“语或轻发”，而且事后已“深自悔咎”了。文章又说苏轼少有大志，又遇杰出明主，深欲报效朝廷，但其朝中势力孤单，除兄弟外无人搭救。文章最后说自己以“乞纳在身官”为兄长赎罪，希望能“赦其万死，使得出于牢狱”，兄弟二人将“洗心改过，粉身报效”。全文动之以情，诉之以理，颂之以德，既要皇上开恩，又不能得罪御史台的官员，所以文字哀恳委婉，有很强的感染力。苏轼后来能平安出狱，此文的作用不能低估。
苏轼从被捕开始，就时刻感觉到了死的威胁，他与儿子约定了暗号：无事送肉菜，有凶信送鱼。苏迈去陈州借钱时，托付友人送饭，友人不知此内情，给苏轼送去了几条熏鱼。苏轼以为事情恶化，当即写了两首绝命诗《狱中寄子由二首》，托一个对自己友善的狱卒设法交给苏辙。其中第一首表达了兄弟间生死离别时的哀怨、凄楚的情感：
圣主如天万物春，小臣愚阁自忘身，百年未满先偿债，十口无家更累人。是处青山可埋骨，他年夜雨独伤神。与君世世为兄弟，更结人间未了因。
苏辙见到诗后伏案痛哭不已，但并没有收下诗稿，而是让狱卒将诗送交官府，想办法转交给皇帝。后来宋神宗果然见到了这两首诗，读完后也大受感动。
宋仁宗妻曹太后也为营救苏轼出了把力。据方勺《泊宅编》载，苏轼既就逮，下御史府。一日慈圣曹太后语上曰：“官家何事数日不译？”对曰：“更张数事未就绪，有苏轼者，辄加谤汕，至形于文字。”太后曰：“得轼、辙乎？”上惊曰：“娘娘何以闻之？”曰：“吾尝记仁宗皇帝策试举人罢归，喜而言曰：联今日得二文士，谓苏轼、辙也，然吾老矣，虑不能用，将以遗后人，不亦可乎？”，因泣问二人安在，上对以轼方系狱。则又泣下，上亦感动，始有贷轼意。
退职宰相张方平、范镇等许多元老重臣都纷纷出面营救苏轼。变法派中坚人物章撑也极力为苏轼开脱。就连下野的王安石也说：“岂有盛世而杀才士者乎？”这场轰动朝野的乌台诗案才得以收场。
实际上，神宗也很赏识苏轼的才华，没有处死他的意思。这一点，苏轼是很清楚的，他在《杭州召还乞郡状》中说：“臣缘此惧祸乞出，连三任外补。而先帝眷臣不衰，时因贺谢表章。即对左右称道。党人疑臣复用，而李定、何正臣、舒宜三人，构造飞语，酝酿百端，必欲致臣于死。先帝初亦不听，而此三人执奏不已，故臣得罪下狱……到狱，即欲不食求死。而先帝遣使就狱，有所约救，故狱吏不敢别加非横。臣亦觉知先帝无意杀臣，故复留残喘，得至今日，及窜责黄州，每有表疏，先帝复对左右称道，哀怜奖激，意欲复用，而左右固争，以为不可。”据说神宗派了一内侍去狱中观察苏轼的情况，内侍回察：“苏轼睡得很安详。”神宗感慨地说：“我知道他没有亏心事。”
乌台诗案于十二月二十九日结案，贬苏轼为检校水部员外郎黄州团练副使，本州安置，不得签书公事，且“限任”该区，不得擅自离开。从人狱到出狱，他一共在狱中被关押了四个月零十二天。
乌台诗案株连了不少人，王洗、王巩被贬，司马光等被罚金，苏辙贬滴监绮州（今江西高安）盐酒税，五年不得调升。
苏轼的妻子王润之为丈夫担惊受怕，几个月下来消瘦了许多。她极贤惠，尽自己最大的努力相夫教子。苏轼有时回家后心烦，见了忽啦啦围上来扯衣服的小儿们就大声斥之，润之就说，你怎么与孩子一样了呢？接着把孩子们领走。逮捕苏轼时，润之惊恐无语，苏轼说：“你难道不能学杨处士的妻子，对我作一诗乎？”润之被逗笑了，直到苏轼走出老远，才放声大哭。
乌台诗案是以诗定罪的文字狱，它以专制和高压手段对待不同意见，使苏轼对封建官僚机构有了进一步认识，对圣贤道理有了怀疑；一个关心国家，同情人民，一心想在政治上有所作为的官吏，当其行为被当权者不容时，只能是“梦绕云山心似鹿，魂飞汤火命如鸡”了。
