一、发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液中含有大量的菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基和各种微生物代谢产物。微生物发酵液的特性可归纳如下：
①发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；
②悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大；
③固体粒子可压缩性大；
④液体黏度大，大多为非牛顿型流体；
⑤产物性质不稳定，遇热、极端pH、空气氧化、微生物污染、酶分解等作用会引起分解或失活。这些特性使发酵液的过滤与分离相当困难。通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
（一）降低液体黏度
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比，因此降低液体黏度可以有效提高过滤速率。
①加水稀释法：采用加水稀释法虽然能降低液体黏度，但是会增加悬浮液的体积，降低产物浓度，加大后续过程的处理量。而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的黏度必须下降50%以上，才能有效提高过滤速率。
②加热升温法：升高温度可以有效降低液体黏度，提高过滤速率。首先，加热温度必须控制在不影响目的产物活性的范围内。其次，防止细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离和纯化。例如，柠檬酸发酵液采用80～90处理，既可以终止发酵，使蛋白质等胶体物质变性凝固，降低发酵液黏度，有利于过滤，同时又不会由于升温过高使菌体破裂释放出胞内物质而导致杂质增加。
③降解法：发酵液中如含有多糖物质，则最好用酶将它们转化为单糖，以提高过滤速率。例如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可使过滤速率提高5倍。
（二）凝聚与絮凝
凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其凝聚成较大的颗粒，便于过滤。凝聚与絮凝常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理。
1.凝聚
凝聚是在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子和自身基团的电离。在生理pH下，发酵液中的菌体或蛋白质常常有负电荷，由于静电吸引的作用，使溶液中带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层，这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。双电层的电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。
向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子的作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，从而因相互碰撞而产生凝聚。电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（m mol/L）称为凝聚值。根据Schulze-Hardy法则，反粒子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为：Al3+>；Fe3+>；H+>；Ca2+>；Mg2+>；K+>；Na+>；Li+，常用的凝聚电解质有硫酸铝Al2（SO4）3？18H2O（明矾），氯化铝AlCl3？6H2O，氯化铁FeCl3，硫酸亚铁FeSO4？7H2O，Zn SO4；MgCO3等。
2.絮凝
采用凝聚方法得到的凝聚体，颗粒常常是比较细小的，有时还不能有效地进行分离，采用絮凝法则常可形成粒大的絮凝体，使发酵液较易分离。
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。絮凝剂是一种水溶性的高分子聚合物，相对分子质量可达数万至一千万以上，它们具有长链结构，其链节上含有相当多的活性功能团，包括带电荷的阴离子或阳离子以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链结分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥连接时，就形成了较大的絮团，从而产生絮凝作用。
对絮凝剂的化学结构一般有下列两方面的要求，一方面其分子中必须含有相当多的活性官能团，能与胶粒表面相结合；另一方面必须具有长链的线形结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能过大，以便使其具有良好的溶解性。发酵工业适宜的絮凝剂有聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，无机高分子聚合物絮凝剂（如聚合铝盐、聚合铁盐等），以及天然有机高分子絮凝剂（如多聚糖类胶黏物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。
絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于使过滤速度提高，还在于能有效除去杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量。但是絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。同时，在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度，从而影响吸附作用的强弱。絮凝剂的最适添加量往往需通过实验确定，虽然较多的絮凝剂有助于架桥充分，但是，过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层从而使胶粒产生再次稳定现象。絮凝剂添加量对絮凝液滤速的影响。从图中可以看出，絮凝剂的最适添加量为70mg/L。
3.混凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以单独使用。对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥，所以它们常与无机电解质絮凝剂搭配使用。首先加入电解质，使悬浮粒子间的双电层电位降低、脱稳，凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂凝聚成较大的颗粒，无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而大大提高了絮凝的效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。
（三）调整pH
pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质。对于氨基酸、蛋白质等两性物质，在等电点（pI）下，溶解度最小，因此可利用此特性分离或去除两性物质。由于大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH4.0～5.5），利用酸性试剂来调节发酵液pH使之达到等电点，可除去蛋白质等两性物质。此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤。反之调整pH也可以改变某些物质的电荷性质，使之转入液相，对于膜过滤可以减少堵塞和膜污染。
（四）加入反应剂
加入某些不影响目的产物的反应剂，可以消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸盐处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能去除钙、镁离子，并且在发酵液中不会引入其他阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高3～5倍。
（五）加入助滤剂
在含有大量细小胶体粒子的发酵液中加入固体助滤剂，则这些胶体粒子吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，相应地改变了滤饼结构，降低了滤饼的可压缩性，也就减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。选择助滤剂应考虑以下几点。
①粒度：助滤剂颗粒大，过滤速度快，但是滤液澄清度差；反之，颗粒小，过滤阻力大，澄清度高。粒度选择应根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度通过实验确定，一般情况下，颗粒较小的滤饼应采用细小的助滤剂。
②助滤剂的品种：应根据过滤介质选择助滤剂品种。使用粗目滤网时易泄漏，可选择石棉粉、纤维素或二者的混合物，可有效防止泄漏；采用细目滤布时，可使用细硅藻土，若采用粗硅藻土，则悬浮液中的细小颗粒仍将透过预涂层到达滤布表面，从而使过滤阻力增大。滤饼较厚时（50～100mm），为了防止龟裂，可加入1%～5%纤维素或活性炭。
③用量：间歇操作时，助滤剂预涂层的厚度应不小于2mm。连续过滤机中根据过滤速度确定。加入悬浮液中的量，使用硅藻土时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3，粗粒为700～1000g/m3；为使其均匀分散于悬浮液中而不沉淀，通常采用搅拌混合的方式。
④使用方法：助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液中，也可以两种方法同时兼用。对于第二种使用方法，使用时需要一个带搅拌器的混合槽，充分搅拌混合均匀，防止分层沉淀。
二、固-液分离
固-液分离是生物产品工厂中经常遇到的单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都要进行固-液分离。不同性状的发酵液应选择不同的固-液分离方法与设备，如霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，其发酵液大多采用过滤方法处理；而细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，外形尺寸大多在1～10μm范围，其发酵液一般采用高速离心机分离。如果对发酵液采用适当的方法进行预处理，则细菌和酵母菌发酵液也可采用过滤方法进行固-液分离。比如菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处理后，即可用板框过滤机或带式过滤机进行菌体分离。下面简要介绍发酵工业中几种常用的固-液分离设备。
（一）板框压滤机
板框压滤机是一种传统的过滤设备，在发酵工业中广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。与其他设备比较，板框压滤机的优点是：过滤面积大；过滤推动力（压力差）能较大幅度进行调整，并能耐较高的压力差，因而固相含水分低，对不同过滤特性的发酵液适应性强；同时还具有结构简单、维修方便、价格较低、动力消耗少等特点。这种设备的主要缺点是不能连续操作；设备笨重，劳动强度大，卫生条件差；非生产的辅助时间（包括解框、卸饼、洗滤饼、洗滤布、重新压紧板框等）长；生产效率低。自动板框压滤机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装、滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。
（二）硅藻土过滤机
硅藻土是生物工业中应用较为广泛的散粒过滤介质，是一种较纯的二氧化硅矿石。硅藻土过滤机被广泛用于啤酒生产中的冷凝固物的分离和成熟啤酒的过滤，它还多用于葡萄酒、清酒及其他含有低浓度细微蛋白质胶体粒子悬浮液的过滤。一般按所要滤除粒子的大小，选择不同型号的硅藻土。硅藻土的用量则根据悬浮液中固体含量的多少确定。在硅藻土啤酒过滤机中，常采用预涂和直接添加相结合的方法使用硅藻土。一般预涂硅藻土的用量为500g/m2左右，预涂层厚度为2～4mm；在待过滤啤酒中硅藻土的添加量为0.1%左右。
按支撑单元的不同，硅藻土过滤机可分为板框式过滤机、叶片式过滤机和柱式过滤机三种。
（三）真空转鼓过滤机
对于大规模生物工业生产，真空转鼓过滤机是常用的过滤设备之一。它具有自动化程度高、操作连续和处理量大的优点，特别适合于固体含量较大（>；10%）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母菌发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。由于受推动力（真空度）的限制，真空转鼓过滤机一般不适合于菌体较小和黏度较大的细菌发酵液的过滤。此外，采用真空转鼓过滤机过滤所得固相的干度不如加压过滤。
（四）碟片式离心机
碟片式离心机是沉降式离心机的一种，1877年由瑞典的De Laval所发明，是目前工业生产中应用最广泛的离心机。按卸料方式的不同，碟片式离心机分为人工卸料、自动间歇排料和喷嘴连续排料三种形式。其中第一种为间歇操作，每次操作完成后需停机人工卸料；第二种离心机工作一段时间后，在不停机状态下自动打开转鼓外缘处的固体排泄口，借离心力甩出固相；第三种转鼓外缘装有若干喷嘴，在操作过程中连续排出固相（或重相）。前二种适合于悬浮液固相颗粒含量较少的场合。此外，间歇式操作，固相干度较好；而连续操作固相含液量较大，其固相仍具有流动性。
碟片式离心机的分离因数为1000～20000，适应于细菌、酵母菌、放线菌等多种微生物细胞悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。它的生产能力较大，最大处理量达300m3/h，一般用于大规模的分离过程。
（五）倾析式离心机
倾析式离心机靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣，因而亦称为螺旋卸料沉降离心机。其具有操作连续、适应性强、应用范围广、结构紧凑和维修方便等优点，特别适合于含固量较多的悬浮液的分离。这种离心机的分离因数一般较低，大多为1500～3000，因而不适合于细菌、酵母等微小微生物悬浮液的分离。此外，液相的澄清度也相对较差。
在发酵工业中，倾析式离心机常用于淀粉精制和废液处理。用于酒精废糟处理时，离心分离后固相干固物浓度为20%～30%，液相中悬浮物含量为0.5%左右。
三、细胞的破碎
微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。自20世纪80年代以来，随着重组DNA技术的广泛应用，许多具有重大价值的生物产品应运而生，如胰岛素、干扰素、白细胞介素等，但许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。
细胞破碎的目的是释出细胞内产物，其方法很多。按其是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。
（一）机械法
1.珠磨法
珠磨法（bead mill）是一种有效的细胞破碎方法。其工作原理是：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下快速搅拌或研磨，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞壁破裂，释放内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（high-speed bead mill）。瑞士WAB公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机。
2.高压均质法
高压均质法（high-pressure homegenization）又称高压剪切破碎。高压均质器的破碎原理是：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液从阀室与阀杆之间的环隙高速喷出，速度可达450m/s，高速喷出的浆液撞击到静止的碰撞环上，由于突然减压和高速冲击作用，在剪切和撞击力等综合作用下细胞破裂。高压均质器操作压力通常为50～70MPa。
高压均质法与珠磨法相比，前者操作参数少，易于确定，适合于大规模操作；后者操作参数多，一般凭经验估计，在大规模操作中，夹套冷却控温难度较大。珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压均质需配备换热器进行级间冷却；其次，珠磨法破碎在适当条件下一次操作即可达到较高的破碎率，而高压均质往往需循环2～4次才行；再者珠磨机适合于各种微生物细胞的破碎，而高压均质不适合于丝状真菌及含有包含体的基因工程菌。
（二）非机械法
1.化学渗透法
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法（chemical permeation）。
化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各种微生物作用的部位和方式有所不同。如表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎；EDTA螯合剂可用于处理革兰氏阴性菌（如E。coli），它对其细胞外层膜有破坏作用；有机溶剂能分解细胞壁中的类脂；变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能溶解细胞壁外层脂蛋白。
化学渗透法有如下优点：
①对产物释放具有一定选择性，可使一些较小相对分子质量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大相对分子质量的物质仍滞留在胞内。控制条件可以有选择地释放出位于细胞内不同部位的产物，例如用0.2mol/L胍处理E。coli C600-1，5h后其胞内80%的β-内酰胺酶释放出来，而此时总蛋白的释放率仅为4%。
②细胞外形保持完整，碎片少，浆液黏度低，易于固-液分离和进一步提取。
化学渗透法的缺点有：
①通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。
②时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%。
③有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中，需设法分离除去。
2.酶溶法
酶溶法（enzymatic lysis）是一种研究较广的方法，它利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。
常用的溶酶有溶菌酶（lysozyme）、β-1，3-葡聚糖酶（glucanase）、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease）、甘露糖酶（mannanase）、糖苷酶（glycosidase）、肽键内切酶（endopeptidase）、壳多糖酶（chitinase）等，细胞壁溶解酶（zymolyese）是几种酶的复合物。应用酶解法要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其他的处理，如辐照、加高浓度盐及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。酵母细胞的酶溶需用细胞壁溶解酶、β-1，6葡聚糖酶或甘露糖酶。
酶溶法的优点是：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。酶溶法的不足：一是溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用亦不低；二是酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件；三是产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶，这可能是导致酶溶法胞内物质释放低的一个重要因素。
另外，X-press法、超声波法、渗透压法、反复冻结-融化法和干燥法等也可用于细胞破碎。
