生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是以生物活性单元（如酶、抗体、核酸、细胞等）作为生物敏感基元，对被测目标物具有高度选择性的检测器。生物传感器是一门多学科综合的高新技术，它涉及生物、化学、物理、医学、电子技术等多个学科，其优点是选择性好、灵敏度高、反应速度快、运行成本低、能在复杂的体系中对某特定指标进行连续监测。
一、生物传感器概况
生物传感器是由固定化的生物材料及与其密切配合的转换器组成的分析工具。它通过各种物理、化学型信号转化器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的电信号表达出来，从而得出被测物的浓度。
生物传感器的特点：特异性好，特定的生物传感器对所测定物质高度专一，测定时发酵液不需分离即可直接测定；灵敏度高，可检测0.1～1.0mg/L浓度的物质，最小极限为10-4mg/L；稳定性相对较差；生物传感器的生物膜片均为生物活性物质，使用时不能加热杀菌处理，需采用其他方法进行灭菌；制作工艺精细，废品率高。
（一）生物传感器的分类
生物传感器一般可通过从传感器输出信号的产生方式、传感器中生物分子识别元件的敏感物质和信号转化器三个角度进行分类。
②根据转化器和产生信号的不同，生物传感器亦可分成五类，其中以电极式生物传感器应用最为广泛。
③根据传感器输出信号的产生方式不同，可以分为生物亲和型生物传感器、代谢型生物传感器和催化型生物传感器。
（二）应用领域与前景
①发酵工业方面：主要是各种酶传感器和微生物传感器，生物传感器可广泛应用于发酵生产的在线监测。利用氨基酸氧化酶传感器可测定各种氨基酸，包括谷氨酸、L-天冬氨酸、L-精氨酸等十几种氨基酸。乙醇、葡萄糖也可以用相应的酶传感器进行检测。
②环境监测方面：环境监测对于环境保护非常重要。传统的监测方法有很多缺点，分析速度慢、操作复杂、需要昂贵的仪器，无法进行现场快速检测和连续在线分析。生物传感器的发展和应用为其提供了新的手段。应用较多的是各种微生物传感器，用来检测BOD、NH3、NOx、SOx、甲烷等。例如测定生化需氧量（BOD），传统的方法测BOD5需要5d时间，而且操作复杂。使用生物传感器测BOD只需要15min。
③医学方面：在基础研究中，生物传感器可以实时监控生物大分子之间的相互作用。借助这一技术动态观察抗原、抗体之间结合与解离的平衡关系，较为准确地测定抗体的亲和力及识别抗原表位，帮助人们了解单克隆抗体特性，有目的地筛选各种具有最佳应用潜力的单克隆抗体。此方法较常规方法省时、省力，结果也更为客观可信，在生物医学研究方面已经有较广泛的应用。
在临床应用上，用酶、免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提供依据。如美国YSI公司推出的一种固定化酶型生物传感器，利用它可以测出运动员锻炼后血液中存在的乳酸水平或糖尿病患者的葡萄糖水平。生物传感器还可以预知疾病发作。如癫痫患者可戴着一个微小传感器，使用头皮上的电极预感癫痫发作，平均可以在7min之前预知癫痫发作的到来。慕尼黑Max Plank生物化学研究所将蜗牛神经细胞置于一个硅芯片上，使用微型塑料桩将它们围在特定位置，邻近的细胞彼此之间以及与芯片之间形成连接。每个神经细胞受刺激后产生电冲动，作用于芯片上的电冲动从一个神经细胞传到另一个，再传回到芯片。这种生物芯片可以在脊髓受损部分建立起连接的“桥梁”，也可以作为生物传感器检测作用于神经细胞上的有毒物质或药用物质。
利用生物工程技术生产药物时，将生物传感器用于生化反应的监视，可以迅速地获得各种数据，有效地加强生物工程产品的质量管理。生物传感器已在癌症药物的研制中发挥了重要的作用，如将癌症患者的癌细胞取出培养，然后利用生物传感器准确地测试癌细胞对各种药物的反应，经过这种试验就可以快速地筛选出一种最有效的抗癌药物。
二、生物传感器的原理
如前所述，生物传感器种类很多，下面以电极式为例，来说明生物传感器的工作原理。电极式生物传感器是由具有识别功能的固定化生物催化膜和具有转化器功能的电极组成。电极式生物传感器的工作原理。常用的生物催化剂有酶、微生物、抗体、抗原、细胞器及细胞组织等。
电极式生物传感器的工作原理模式为：被测物质与固定化生物催化剂膜上的电极活性物质进行生物化学反应，所形成的化学物质再与电极发生电化学反应，将信号转换成可传输和记录的电信号，由检测器进行记录和处理。
电极活性物质是指易于在电极上反应的物质，是反应生成或消耗的物质。例如在乳酸测定中，乳酸氧化酶作为生物催化剂膜，使用氧电极进行测定，乳酸在乳酸氧化酶催化下反应消耗O2，使电极周围的氧浓度减小，电化学反应速度下降，氧电极的输出信号（电流）减小，根据其电流值下降的幅度即可推算出被测液体中乳酸的浓度。在L-赖氨酸测定中，L-赖氨酸脱羧酶作为生物催化剂膜，使用CO2电极进行测定，L-赖氨酸与L-赖氨酸脱羧酶反应生成CO2，从而使电极上的电压上升。
电极式生物传感器分为电流法和电压法两种。电流法是指电极活性物质在电极上反应产生电流，根据电流大小求出待测物质浓度。常用电极有氧电极、H2O2电极、燃料电池型电极等。电压法是指电极活性物质有选择地感应产生膜电压，根据膜电压的变化求出待测物质浓度。常用电极有：离子选择电极、氨电极、CO2电极等。
有时被测物质与固定化生物催化剂膜发生生物化学反应，产生热或光，这时可通过热敏电阻转换成电信号或通过光计数器转化成电信号。
三、信号转换器
（一）电化学型信号转换器
电化学电极包括固体电极、离子选择性电极、气敏电极等，它们作为信号转换器已经广泛应用于酶传感器、微生物传感器及其他类型的生物传感器中。电化学信号转换器测量的信号有电位信号和电流信号。
①电位信号测量方法：对于一个选择性膜电极，当外界条件固定时，膜电位与溶液中待测离子活度（或浓度）的对数值呈线性关系，即符合能斯特关系式。由于单个电极电位值是无法测量的，通常将待测电极与一个参比电极组成一个电池，测量其电位差值。采用的参比电极除了可使用标准氢电极外常常使用甘汞电极和银-氯化银电极。生物传感器中常涉及电位法测量H+、NH3、CO2的浓度。
②电流信号测量方法：被测物质在电极上发生氧化或还原反应与其自身的电极电位有关，控制电极电位可以有选择地使溶液中某些成分发生氧化或还原反应。当电路中有电流通过时电极将发生极化现象，使得电极电位偏离平衡电位值。为了有效地测量和控制研究电极的电位，通常可采用三电极测量体系。电解回路由工作电极和辅助电极构成，电位的测量和控制由参比电极与工作电极回路实现。测量时采用线性扫描法、恒电位法等，测量的电流信号与发生电极氧化或还原的物质浓度相关。
（二）热敏电阻型信号转换器
在众多的热敏元件中，热敏电阻是一种十分有效的温度传感器。热敏电阻是由铁、镍、锰、钴、钛等金属氧化物构成的半导体。从外形上分类有珠型、片型、棒型、厚膜型与触点型等。凡有生物体反应的地方，大都可观察到放热或吸热反应的能量变化。热敏电阻生物传感器就是以测定生化反应焓变化作为测定基础的。
作为温度传感器的热敏电阻具有如下几个特点：
①灵敏度高，温度系数为-4.5%/K，灵敏度约为金属的10倍；
②因体积很小故热容量小，响应速度快；
③稳定性好，使用方便，价格便宜。
（三）光纤光学型信号转换器
光纤是用来传输光波能量的。在传输过程中，光波的导波参量会发生变化，如振幅、相位、偏振度、强度、波长、频率等，尤其是外界因素（如压力、温度、振动、浓度）对光纤产生作用更会引起上述参量发生较大的变化。光纤生物传感信号转换器主要由光纤和生物敏感膜组成。分析测试时将传感器插入待测溶液中，当光通过光纤达到传感端时，由于传感膜中生物活性成分和待测组分之间的相互作用引起传感层光学性质的变化。将酶、辅酶、生物的受体、抗原、抗体、核酸、动植物组织或细胞、微生物等敏感膜安装在光纤、平面波导或毛细管波导面上，对样品中的待测物质进行选择性的分子识别，再转换成各种光信息，如紫外光、可见光及红外光的吸收或反射，荧光、磷光、化学发光和生物发光、拉曼散射和表面等离子体共振等信号输出。组成感受器和换能器的可以是同一物质或不同物质组成的单层膜，也可以是不同物质构成的双层膜（复膜）。在大多数情况下，光纤只起光的传输作用。也有传感器是基于被测物质能直接影响光纤的波导性质（如张力或折射率的变化）来进行化学或生物传感的。
光纤生物传感器具有如下优点：
①轻、细长、小，很细小的光纤探针可应用于生物体内研究；
②抗电磁干扰强，适用于在强电磁干扰、高温高压、易燃易爆和强放射性等恶劣环境中应用，使远距离遥测成为现实；
③应用范围广、成本低且操作方便；
④可应用于多波长和时间分辨测量技术，从而改进分析结果的重现性，大大提高方法的选择性。
光纤生物传感器的探头直径可以小到与其传播的光波波长属同一数量级（nm级），这样小巧的光纤探头可直接插入那些非整直空间和无法采样的小空间（如活体细胞、血管、细胞）中，对分析物进行连续测定。
目前，利用酶反应的高选择性和利用免疫反应专一性的光纤生物传感器已受到人们越来越多的重视，如利用将氧化酶固定在探头上来测量胆甾醇、利用微生物的氧化分解性质将其固定在光纤末端来测量生化耗氧量、把碱性磷酸酶固定在光纤末端尼龙网上利用催化反应测定对硝基苯酚。光纤生物传感器研究方兴未艾，各种新方法、新应用也层出不穷。
四、酶传感器
酶传感器是应用固定化酶作为敏感元件的生物传感器。依据信号转换器的类型，酶传感器大致可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器。
（一）酶电极传感器中酶反应与转换器的耦联
酶电极是由固定化酶与离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极组合而成的生物传感器，因而具有酶的分子识别和选择催化功能，又有电化学电极响应快、操作简便的特点，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度，且只需很少量的样品。目前，酶电极用于糖类、醇类、有机酸、氨基酸、激素、三磷酸腺苷等成分的测定。
耦联关系是指酶反应所生成或消耗的某种物质，能被转换器转换成电信号。
（二）固定化酶膜（EBM）的制备
1.固定化方法
物理吸附法是指酶或其他生物组分在电极表面的物理吸附，是一种较为简单的固定化技术，无需化学试剂、极少的活化和清洗步骤，同其他化学法相比，对生物分子活性影响较小。但对溶液的pH变化、温度、离子强度和电极基底状况较为敏感，生物组分容易从电极表面脱落，而不被广泛采用。此法主要通过极性键、氢键、疏水力将生物组分吸附在不溶性的惰性载体上。常用的载体有多孔玻璃、活性炭、氧化铝、石英砂、纤维素膜、葡萄糖、琼脂糖等，已用此法固定的酶有脂肪酶、过氧化物酶等。
离子交换吸附法是选用具有离子交换性质的载体，在适宜的pH下，使生物分子与离子交换剂通过离子键结合起来，形成固定化层。常用的载体有二乙胺乙基纤维素、四乙胺乙基纤维素、羧甲基纤维素、阴离子交换树脂等。用此法制备的固定化酶有葡萄糖淀粉酶、D-葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、胆固醇氧化酶、肌酸激酶等。
②包埋法：包埋法是将生物组分包埋于高分子三维空间网状结构中，形成稳定的生物组分敏感膜。该技术的优点是：可以采用温和的实验条件及多种凝胶聚合物；大多数生物组分可以很容易地掺入聚合膜中，一般不产生化学修饰，对生物组分的活性影响较小；膜的孔径和几何形状可任意控制，可固定高浓度的活性生物组分等。其局限性为必须控制很多实验因素；聚合物形成过程中产生的自由基对生物组分可能产生去活化作用等。
包埋法分为聚合物膜包埋法、电聚合物膜包埋法和溶胶-凝胶膜包埋法。
③共价键固定法：为将生物组分通过共价键与电极表面结合而固定的方法。通常要求在低温（0）、低离子强度和生理pH条件下进行。通常包括三个步骤：基底电极表面的活化、生物分子的偶联、剩余价键的封闭及除去键合疏松的组分。
信号转换器探头的基底材料多为金属（如铂、金、钛）、氧化物（如二氧化硅）及石墨等。所以，首先必须在基底表面引入可修饰的功能团。其主要方法有单层膜共价键固定法和聚合物膜共价键固定法、交联共聚法。
2.酶膜的性质
不同的酶膜具有不同的响应特性，包埋法制备的酶膜响应时间较长，而共价法、交联法制备的酶膜响应时间较短。
酶膜的使用寿命与使用环境和保存的环境有关，一般为一个月左右。
3.酶膜制备实例
350U乙醇氧化酶、1mL5%（体积分数）聚乙烯亚胺、10mg牛血清蛋白溶液，混合后5反应4h，加0.2ml 15%戊二醛溶液，5反应24h，包于聚碳酸酯膜和醋酸纤维素膜之间，制成乙醇氧化酶膜（厚度20μm）。
（三）酶传感器实例
1.葡萄糖传感器
①传感器组成：葡萄糖氧化酶与聚丙烯酰胺凝胶混合后，用包埋法制备成葡萄糖氧化酶膜，与氧电极构成葡萄糖传感器。
②电极反应：在酶膜上，葡萄糖（C6H12O6）在有氧条件下，在葡萄糖氧化酶的催化下，与氧发生反应，形成葡萄糖酸（C6H10O6）和过氧化氢（H2O2）。
③测定原理：待测溶液中葡萄糖在酶膜上葡萄糖氧化酶的催化下进行氧化反应，使电极周围的O2浓度降低，通过电化学反应使浓度的降低转变为电流值的降低，由此可以推算出葡萄糖的浓度。
④主要性能：测量范围较宽，可以测量1～500mg/L；响应时间短，只有10～30s；使用寿命较长，可以连续使用60～100d。
此外，葡萄糖氧化酶膜亦可与过氧化氢电极组成葡萄糖传感器：
2.乙醇传感器
①传感器组成：由H2O2电极和乙醇氧化酶膜组成乙醇传感器。
②电极反应：在酶膜上乙醇（C2H5OH）在乙醇氧化酶的催化下，在有水存在的情况下，与氧反应，形成乙醛（CH3CHO）和过氧化氢（H2O2）。
③测定原理：乙醇在乙醇氧化酶的催化下在酶膜上进行反应，生成H2O2，再与H2O2电极发生电化学反应，使电极的电流值增大，由此推算出乙醇浓度。
④电极主要性能：测量范围：0～30%（体积分数）；相对误差：2%；响应时间：20s；使用寿命：半衰期30d左右。
五、微生物传感器
在不损坏微生物机能情况下，可将微生物固定在载体上制作出微生物敏感膜。微生物传感器与酶传感器相比，有以下特点：
①微生物的菌株比分离提纯的酶的价格低得多，因而制成的传感器便于推广普及；
②微生物细胞内的酶在适当的环境中活性不易降低，因此微生物传感器的寿命更长；
③即使微生物体内的酶的催化活性已经丧失，也还可以因细胞的增殖使之再生；
④对于需要辅助因子的复杂的连续反应，应用微生物则更容易完成。
（一）微生物传感器的原理与分类
微生物传感器从工作原理上可分为两种类型，一类是以微生物呼吸活性为指标的呼吸活性测定型，另一类是以微生物代谢产物为指标的电极活性物质测定型。
1.呼吸活性测定型
呼吸活性测定是基于微生物呼吸量及氧浓度在有机物被利用前后不同，通过测量O2电极扩散电流值的变化，从而间接测定有机物浓度。传感器生物活性物质必须是好氧微生物。
被测物质在固定有好氧微生物的电极膜上被微生物利用，溶液中的氧被微生物消耗，使溶液中的溶解氧浓度下降，氧电极上的电流值随着下降，氧浓度下降与被测物质的浓度相关，由此可以测定被测物质的浓度。溶液中被测物质被微生物利用时会产生CO2，使CO2电极的电位值升高，电位值的升高与被测物质的浓度相关，由此可以测定被测物质的浓度。
2.电极活性物质测定型
此型微生物传感器是微生物利用试样中的有机物后，生成各种代谢产物，这些代谢产物中包含有CO2气体、氨气、甲酸、还原型辅酶等电极活性物质，通过电极转换成电流或电压值，即可测定有机物质的浓度。
（二）微生物传感器实例
1.谷氨酸传感器
测定谷氨酸的微生物传感器是由具有较高谷氨酸脱羧酶活性的微生物膜和CO2电极组成。
①传感器制备：大肠杆菌细胞→冷冻干燥→用水调匀→涂布于尼龙网（60目，7mm）两面→置于CO2电极上→外用赛璐璐膜盖住→谷氨酸传感器。
②测定原理：大肠杆菌中含有较多谷氨酸脱羧酶，在无氧条件下若无谷氨酸存在，不产生CO2，当有谷氨酸存在时，则产生CO2，使CO2电极电位升高，由此可以推算出谷氨酸的含量。
③专一性：测量时如有谷氨酰胺存在，传感器会对谷氨酰胺有响应，可用丙酮酸处理减少影响，其他氨基酸的作用可忽略；当葡萄糖含量<；7.9g/L、醋酸含量<；0.2g/L时，对测量不产生影响；无机离子影响可忽略。
④主要性能：传感器的响应时间为5min左右；测量范围为10～800mg/L；使用寿命约20d。
2.氨传感器
硝化菌膜上的微生物代谢NH4+，消耗O2使电极周围O2浓度下降，通过电化学反应使氧电极上电流值下降，进而推算出NH4+浓度。
②传感器制备：活性污泥中分离得到的硝化菌，固定于乙酸纤维素膜上，将其安装于氧电极上构成测定铵（氨）的微生物传感器。
③主要特性：响应时间为2min（pH=10的缓冲溶液中）；测量范围在1～42mg/L；相对误差<；4%；使用时间为20d左右。
