工业发酵种子的制备过程大致可分为实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段。实验室种子制备阶段包括孢子制备、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养；生产车间种子制备阶段包括摇瓶液体种子制备和种子罐扩大培养。
一、实验室种子制备
实验室种子制备包括孢子制备和摇瓶液体种子制备。孢子制备是发酵工序的开端，也是一个非常重要的环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵水平都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺各有不同的特点，但都需采用有利于生长大量孢子、不易引起菌种变异、又能防止杂菌污染的工艺条件。
（一）放线菌类孢子的制备
制备放线菌类孢子，培养基的原料一般采用琼脂和其他一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、牛肉膏和一些无机盐等，其中的碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1%，氮源不超过0.5%）。因为碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子的形成；而氮源丰富有利于菌丝繁殖而不利于孢子的形成。碳氮比例大一些为好，这样避免菌丝的大量形成，有利于产生大量孢子。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子的形成。
放线菌种子扩大培养的工艺过程为：
砂土管→一级斜面→二级斜面→摇瓶（菌丝）→种子罐→发酵罐
放线菌类孢子的培养温度大多数为28，部分菌种为30或37.培养时间因菌种不同而有所不同，一般在4～7d，也有的为14d左右。孢子成熟后，于5冰箱（库）内保存备用。存放时间不宜过长，一般在一周以内，少数品种可存放1～3个月。
制备孢子时，根据孢子（菌体）生长快慢，可以将保藏在砂土管或冷冻管中的菌种接入斜面进行培养，培养成熟后制成孢子（菌体）悬浮液，再接入种子罐；也可以进行两次斜面活化培养，待培养成熟后，制成孢子（菌体）悬浮液，再接入种子罐。生产中采用哪一级的斜面孢子，要视菌种特性而定。采用一级斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异，采用二级斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。
（二）霉菌类孢子的制备
霉菌类孢子的制备多数采用大米、小米、玉米、麦麸等天然农产品为培养基原料。这些原料来源丰富，简单易得，价格低廉，适合霉菌的生长繁殖。这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。制备大（小）米培养基，要严格控制灭菌后培养基的含水量，使其不粘不散。接种时，先将砂土管或冷冻管中的菌种制成悬浮液，再把一定量的悬浮液直接接入大（小）米培养基上，培养成熟后称为“亲米”。由亲米再转至大（小）米培养基上，培养成熟后称为“生产米”，用“生产米”接入种子罐内。也可将菌种先进行琼脂斜面培养，再制成孢子悬浮液，然后将悬浮液接入大（小）米培养基上，培养成大（小）米孢子，最后转入种子罐内。
霉菌的培养温度一般为25～28，培养时间随菌种而不同，一般为4～14d。为了使通气均匀，在培养过程中要注意翻动。
制备好的大（小）米孢子，在4的冰箱中保存备用，或将大（小）米孢子在真空情况下除去水分（抽到含水量在10%以下），保存备用。
（三）细菌类孢子的制备
制备细菌类孢子，斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。牛肉膏、蛋白胨是常用的有机氮源。细菌培养温度大多数为37，少数为28.细菌菌体培养时间一般为1～2d，产芽孢的细菌则需培养5～10d。
无论采用哪一种制备孢子的方法，在制备过程中都要严格进行无菌检查，即把接种用的接种针或吸管做无菌试验。培养好的斜面也要仔细检查其是否有杂菌污染。
二、生产车间种子制备
生产车间种子制备的目的是为发酵生产提供一定数量和质量的种子。生产车间种子制备包括摇瓶液体种子制备和种子罐种子制备两个阶段。
（一）摇瓶液体种子制备
某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需要将孢子经摇瓶液体培养成菌丝后再接入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶相当于缩小了的种子罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。
将斜面孢子接种到体积较小的摇瓶（母瓶）中，经培养形成大量菌丝后，再转接到体积较大的摇瓶（子瓶）中培养，这种摇瓶培养方法称为母瓶-子瓶两级培养。摇瓶进罐法常采用母瓶-子瓶两级培养。有时母瓶也可以直接进发酵罐。种子培养基要求营养丰富，并易被菌体分解利用。氮源丰富有利于菌丝生长。原则上，培养基的浓度不宜过高，母瓶培养基浓度比子瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。
（二）种子罐种子制备
种子罐的作用是将有限数量的孢子或菌丝生长并繁殖成大量的菌丝体。种子罐的级数是指制备种子需要逐级扩大培养的次数。种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而有差异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子（或摇瓶菌丝）被接种到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子。把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入到体积较大的种子罐中，经培养后形成更多的菌丝，这样的种子称为二级种子。把二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
一般应根据菌种生长特性、孢子发芽和繁殖速度以及所采用的发酵罐容积来确定种子罐的级数。抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常采用二级种子扩大培养，即三级发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。而谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。
三、基因重组微生物种子的培养
工程菌经过发酵诱导表达目的产物以及纯化等一系列程序可以生产出许多人类所需要的目的产物。基因重组微生物已得到广泛应用，开发出不少产品投放市场。在医药方面，现在已有多种蛋白、多肽类药物研制成功并应用于临床，如重组大肠杆菌表达生产人干扰素、白细胞介素、人生长激素以及集落刺激因子等。在氨基酸基因重组微生物组建上，已获得了成功，如高产的苏氨酸基因重组微生物。最近还成功地应用基因工程技术组建成能直接转化葡萄糖为2-酮基-L-古龙酸的基因重组微生物，为维生素C生产开辟了新的途径。在抗生素生物合成上，已成功地把基因工程技术应用于提高抗生素的产量上，如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素C的产量提高了15%。
利用基因工程技术构建的基因工程菌的发酵生产不同于传统的微生物发酵生产。就其选用的生物材料而言，基因工程菌是带外源基因重组载体的微生物，而传统的微生物不含外源基因；从发酵工艺上考虑，基因工程菌发酵生产的目的是使外源基因高效表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，以获得大量的外源基因产物，而传统微生物发酵生产的目的是活的微生物自身基因表达所产生的初级或次级代谢产物。外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系，而且与其所处的环境息息相关。要实现基因工程工业化生产，除了要构建高效的载体――宿主系统外，基因重组微生物的培养也是十分重要的。
（一）基因重组微生物菌株的选择
基因工程的关键问题是目的基因在宿主细胞中能否表达，即外源DNA在宿主细胞中能否转录和翻译，表达形成的产物在细胞内不被分解，并能分泌到胞外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。
比较理想的、能够在工业上使用的基因重组微生物菌株除了具有高浓度、高产量、高产率的特点外还应满足下列要求：能利用易得的廉价原料；不致病，不产生内毒素；容易进行代谢调控；易于进行重组DNA技术。
用于基因表达的宿主细胞分为两大类，第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。大肠杆菌作为真核基因的表达宿主，有其遗传背景清楚、技术操作简便、培养条件易控制、大规模发酵成本低等特点，是当前发酵生产上使用较多的基因表达宿主细胞。
在大肠杆菌中，多种哺乳动物和其他微生物的蛋白基因能够得到高效表达，产物能得到过量生产，产量可达到大肠杆菌菌体总蛋白的50%（如人胰岛素）。目前已构建成功多种大肠杆菌高效表达系统，这就为生产多种蛋白药物（如白细胞介素-2、人生长激素、干扰素等）提供了基础。但大肠杆菌不具备分泌系统，产生的产物以包涵体（inclusion body）形式存在于细胞质中，这给分离纯化造成了困难。因此，目前正在研究能分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌系统。
（二）基因重组微生物的培养方法
基因重组微生物的培养主要包括两个方面，一是通过摇瓶培养了解基因重组微生物生长的基本条件，如温度、pH、培养基配比等，分析表达产物的合成和积累对受体细胞的影响。另一方面，通过培养罐操作确定培养参数及其控制方案。
基因工程菌培养常用的方式有：补料分批培养、连续培养、透析培养和固定化培养。
1.补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中，为保证基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
2.连续培养
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，启动进料和出料的蠕动泵，控制一定稀释率进行不间断培养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造良好条件。
但是由于基因工程菌质粒的不稳定性，连续培养比较困难。为解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中，关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞生长速率。优化这三个参数可以保证在第一阶段培养时质粒稳定，在第二阶段可获得最高表达水平或最大产率。
3.透析培养
透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。
4.固定化培养
基因重组微生物培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因重组微生物经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌种更为有利。因此这种培养方法的研究已得到迅速开展。
（三）基因重组微生物种子的扩大培养
从整体上看，基因重组微生物种子的扩大培养过程与普通的好气性微生物种子的培养过程基本相同，也需要经过斜面培养、摇瓶液体培养、种子罐培养三个步骤。因此，基因重组微生物种子的具体制备方法可参考上面普通微生物种子的制备。
如前所述，与普通微生物相比，基因重组微生物的生理特性和发酵生产目的均具有一定的特殊性，而且基因重组微生物在传代过程中还经常出现质粒不稳定现象，所以在基因重组微生物种子制备过程中，更应该对影响基因重组微生物种子质量的主要因素进行分析，控制好每一步操作，探索出一套既适合微生物大量生长，又能保持重组质粒的稳定性，使外源基因高效表达的基因重组微生物种子培养工艺。
