一般认为经过处理的异种骨，生物相容性是好的，植入体内后起骨传导作用，但缺乏诱导成骨作用，用于修复骨折、骨缺损效果不确定。单纯异种骨应用于临床，早期报道结果不一。异种骨移植促进骨愈合多以复合形式使用，如可复合自体红骨髓或BMP之类的骨生长因子。Salama等将复合自体红骨髓的Kiel骨用于治疗假关节、关节融合术、良性骨肿瘤切除后及创伤性骨缺损等，有一定疗效。此法须将Kiel骨浸润活骨髓，由于实地操作诸多不便，效果不确切，未能广泛应用于临床。国内学者将经过脱蛋白处理的异种骨骨粒分别复合牛BMP和兔自体红骨髓，用以修复兔桡骨于1.5cm缺损，发现牛BMP包被的异种骨粒与兔自体红骨髓包被的骨粒具有大致相同的诱导成骨作用，在术后12～16周使骨缺损基本修复和桥接。异种骨的抗原成分和其中的诱导成骨物质同为蛋白质分子，能破坏异种骨抗原性的各种理化因素必然影响其成骨活性，因而在消除抗原性的同时难以保留诱导成骨能力。
第四军医大学骨科研究所根据对异种骨移植免疫学的深入研究，认为只有将异种骨抗原性和诱导活性分开处理，才不致在处理异种骨时顾此失彼，这是异种骨移植成功的关键。该所根据这种新思路，创新研制出“重组合异种骨”。重组合异种骨（reconstituted bone xenograft，以下简称RBX），是将牛松质骨进行部分脱钙和脱蛋白处理，同时由皮质骨提取成骨活性物质BMP，然后将二者在适当条件下重新组合，其主要特点是高诱导活性的BMP和去抗原松质骨支架的再结合。
一、RBX的制备
1.BMP提取
以小牛皮质骨为原料，按Urist法改良提取BMP，所获最终产物为BMP粗提物。小鼠肌袋生物活性分析表明，此粗提物具有相当高的诱导成骨活性；SDS-PAGE凝胶电泳显示，其中含有多种蛋白组分。
2.牛松质骨处理
将牛松质骨制成3～5mm大小的颗粒，用1：1氯仿甲醇脱脂，先后浸泡于H2O2液中脱蛋白、0.6M盐酸部分脱钙，然后冻干。经测定，此种松质骨粒之组成为：有机质44.39%，无机质54.30%，水1.31%。在扫描电镜下骨粒呈疏松多孔状结构，孔径300～500μm，孔间隔厚度60～100μm，孔洞间尚有微孔串联，其孔径为50～80μrn。
3.BMP与松质骨载体的重组
合称取一定量的BMP，使溶于适量的4M盐酸胍/0.05M氯化钙溶液，其中加入一定量的部分脱钙松质骨载体，真空排气除去孔隙中之气体，对蒸馏水透析、冻干，灭菌后分装，即为RBX成品。根据需要，BMP与载体支架之比例可为1：20至1：100.扫描电镜下可见RBX呈实体性疏松绒毛结构，松质骨孔洞内填充云絮状或网纱样BMP物质，高倍镜下可见其部附于松质骨孔洞壁上，二者结合良好。
4.抗感染重组合
异种骨对于污染性或感染性骨缺损，传统的治疗方法是：先清创或做病灶清除，应用抗生素消灭残存致病菌，待伤口闭合、确定无感染迹象3～6个月后，再11期植骨修复。笔者在应用RBX成功治疗骨不连、骨缺损的基础上，结合抗生素局部缓释技术，研制成抗感染RBX（antiinfective RBX， ARBX）。方法为用庆大霉素明胶液包裹RBX骨粒，再将此骨粒浸入聚乙内酯/四氢呋喃液，以增强其缓释作用。
二、RBX的生物活性分析
1.小鼠肌袋骨诱导模型
将20mg RBX（内含0.5mg BMP）植入小鼠一侧股部肌间隙，对侧植入不含BMP之部分脱钙松质骨载体作为对照。RBX植入后1周，有大量分化的间充质细胞以旋涡状簇集于移植骨周围，在移植骨与肌纤维之间已有软骨细胞分化形成；对照侧主要表现为纤维结缔组织包绕移植骨。2周后，植入RBX之一侧软骨岛增大，中心发生骨化，移植骨孔隙内及移植骨与肌纤维之间有新骨组织形成，有些小梁骨直接与孔间隔相连，有些部位可见成熟板层骨和脂肪性骨髓。此时，对照侧仍以纤维组织为主，移植骨周围可见结缔组织细胞增生，松质骨支架大部吸收，残留部分为类纤维组织包裹。
2.受体血清免疫
荧光检测处死动物时采取血标本进行免疫学检查。将不脱钙冷冻骨切片（6pm）投入小鼠血清进行免疫荧光染色，检测血清中有无特异性抗体。结果发现，所有植入RBX的动物均出现阳性反应，黄绿色荧光分布于哈佛管壁、骨细胞及周围陷窝上，骨基质阴性。在植入未经处理的异种松质骨后，抗体滴度可高达1：256.而植入经过处理的异种骨后，仅出现1：2低滴度抗体，实验证明对移植骨并无明显影响。
三、RBX的骨缺损修复能力
1.RBX修复家
兔骨缺损在兔两侧桡骨造成15mm的缺损，左侧缺损处植入80mg之RBX（其中含BMP4mg， BMP/载体比例为1：20），右侧缺损旷置作为空白对照。术后4、8上6周处死动物。自第3日起RBX植入处出现梭形包块，质地坚韧。l周后包块缩小，质地变硬，伤口愈合好。X射线片显示术后4周RBX植入处有大量新生骨痂影，密度高，形态不规则，移植骨明显吸收。8周时，RBX植入处基本为新生骨痂影充填，部分标本已有明显塑形改建。至术后16周，植入RBX之缺损已基本修复，板层骨形成，髓腔再通；对照侧发生缺损性骨不连。组织学检查：术后4周可见RBX植入处大量骨软骨组织诱导分化，松质骨孔洞内可见组织细胞长入及新骨形成；移植骨周围无炎性细胞浸润和吞噬现象。8周时新骨组织显著增多，充填移植骨之孔洞内外；移植骨破碎、吸收，与诱导形成的新骨组织紧密连接。对照侧骨缺损为瘢痕组织充填。
应用四环素双标记法追踪骨形成过程，可见RBX植入后早期有活跃的新骨形成，出现大量初期哈佛管系统；而在植骨晚期，荧光标记减少，板层骨成熟，骨组织代谢已进入相对稳定时期，改建过程接近完成。植入块型RBX修复犬桡骨20mm缺损，也获得同样结果。
2.抗感染重组合
异种骨（ARBX）对污染或感染性骨缺损I期植骨的效果
（1）ARBX一期植骨预防
骨髓炎在兔胚骨近端凿成矩形骨窗，注入金黄色葡萄球菌及鱼肝油酸钠，造成污染性骨缺损。实验动物分5组。片刻后，A组植入ARBX骨粒（含庆大霉素30mg）B组植入庆大霉素粉30mg及不含抗生素之等量RBX骨粒，C组和D组单植入RBX骨粒E组无任何植入；但C组行庆大霉素全身给药。术后8周处死动物取材，见A组全部及B组部分标本外观正常，骨皮质缺损区完全修复，塑形良好；其余标本变形，部分残留皮质骨缺损。X射线片有骨髓炎表现，其严重程度为：A＜B＜C＜E＜D， A组之Norden分值明显低于其他各组。细菌学检查A组细菌培养阳性率为0，单纯局部应用抗生素之B组较之全身应用抗生素之C组细菌量显著减少，而C组又比不用抗生素之D上组细菌量少。可见，抗感染重组合异种骨除有良好的骨传导和骨诱导作用外，还有很强的抗感染能力，可有效地预防术后继发感染和骨髓炎。
（2）ARBX一期植骨治疗
骨髓炎如上所述在兔股骨近端凿骨窗造成污染性骨缺损。2周后打开骨窗，见骨窗内有脓性物质。此时将实验动物分6组，A～E组行彻底病灶清除，然后A组于骨窗内植入ARBX骨粒（含庆大霉素30mg）；B组植入RBX骨粒加庆大霉素粉，C组单纯植入RBXE组无任何植入；而在F组，不行病灶清除径直植入ARBX。C组行庆大霉素全身给药。术后8周取材见A组全部及B， C组部分标本外观正常，未发现明显骨质破坏及髓腔脓液；其余标本大多粗大变形，剖面见骨质增生和破坏明显，死骨形成，髓腔有脓液。X射线片上骨髓炎严重程度为：AMB与FMEMC与D组Norden分值明显低于其他各组，F组也低于C组。细菌培养阳性率及每克标本细菌数A组明显低于其他各小组与F组之细菌数差别不大，但明显低于其他各组。上述研究表明，ARBX具有较强的抗生素缓释作用，其抗感染作用优于单纯局部用药，更明显优于全身用药。体外药物动力学研究证实，ARBX可在植入局部维持30d以上的有效抗菌浓度，持续抗菌作用很强。另一方面，因其含有骨生长因子BMP，故具有高效诱导成骨作用，生物相容性及生物降解性均较好，可大大缩短感染性骨缺损的修复时间。因此，在彻底清创或清除病灶后，一期植入ARBX，对于污染或感染的骨损伤，可取得很好的效果。
四、重组合异种骨的临床应用
经过6年的实验研究，RBX成功地应用于临床治疗骨不连、骨缺损数千例，取得满意疗效。目前其适应证大多为创伤所致骨不连、骨缺损，包括肱骨、尺骨、桡骨、指骨、股骨和胫骨等部位；少数为肿瘤切除所致骨缺损，病种包括内生软骨瘤、骨巨细胞瘤及非骨化性纤维瘤等。按患者骨缺损部位、大小及周围软组织情况，植入一定剂量的RBX。RBX植入后一般情况好，无高热或其他过敏反应，相关免疫学检测（循环免疫复合物、淋巴细胞转化率、可溶性白细胞介素受体、淋巴细胞亚群等）无明显异常，伤口一期愈合。部分病例局部肿胀或有少量渗出，数日后即消退，一般无需特殊处理。动物实验证明，早期肿胀是由于BMP发挥诱导作用使大量细胞簇集所致。术后，SPECT显示放射性核素浓集于植骨区域，说明RBX具有高诱导成骨活性。
五、异种骨移植的安全性
（一）异种骨抗原的主要来源
1.天然异种抗原
α-半乳糖基抗原（α-Gal）是公认存在于除灵长目以外的哺乳动物体内的异种抗原，α-Gal在骨中的含量相对要少，主要分布于哈佛管内皮细胞的细胞膜上。Tearle等认为存在非α-Gal的异种抗原。但该抗原是否在骨中分布则还不清楚。
2.主要组织
相容性复合物（MHC）决定的细胞表面糖蛋白MHC-Ⅰ型抗原分布于所有的有核细胞，即骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等的细胞膜表面均表达MHC-Ⅰ型抗原，但含量较其他组织少。MHC-Ⅱ型抗原的组织分布有种属差异性，而在骨中的分布则不清楚。
3.骨中的胶原、基质骨中的胶原、基质也具有抗原性，骨胶原主要是Ⅰ型胶原，一般认为在各种系间组成差异不大，抗原性均很弱。骨中的矿物质成分不具有抗原性。
4.血型抗原、组织特异性抗原等一般认为骨骼不表达。
5.松质骨中的骨髓、血液成分骨髓和血液中的细胞成分，其细胞膜表面表达α-Gal、MHC-Ⅰ等，也具有抗原性。
（二）异种骨移植免疫排斥反应的类型
1.体液免疫
人血清中天然存在的抗α-Gal抗体与α-Gal结合，通过经典途径和替代途径激活补体，攻击移植物。另外，异种胶原能刺激受者产生抗体，但抗体的产生与移植排斥反应没有明显的关系，对成骨过程无影响。
2.细胞免疫
异种非血管吻合组织移植以细胞免疫为主。T细胞介导的免疫排斥反应：移植物上的MHC抗原通过两种途径被受体T细胞识别。由于供、受体MHC分子差异较大，导致供、受体间MHC抗原的直接呈递较难进行，因此间接呈递可能起主要作用。MHC抗原被受体的APC摄取，经加工处理，呈递给受体T细胞，引发免疫排斥反应。其他证据也表明，异种细胞间的直接识别几乎不发生，T细胞反应仅限于间接途径。因此，异种细胞的免疫排斥反应比同种细胞弱。
特异性细胞介导的免疫排斥反应：自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞膜表面表达MHC-Ⅰ分子，在异种移植中因供体、受体MHC-Ⅰ分子不同，受体的NK细胞可对移植物攻击。Seebach等认为：在自体、同种移植中，由于供体细胞的MHC-Ⅰ分子中编码有一种抑制性分子，该分子可与NK细胞的抑制性受体结合，该受体表达MHC-Ⅰ分子，结合后将信号传给MHC-Ⅰ分子相同的NK细胞，从而避免受到NK细胞的攻击，在异种移植中，供体、受体的MHC-Ⅰ分子不同而受到NK细胞的攻击。
激活的NK细胞、T细胞及其他炎症细胞也可以释放白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）等炎性细胞因子，趋化淋巴细胞通过血管壁至炎症部位，这些因子又可进一步活化NK细胞及T细胞，促进免疫排斥反应的发生。
新鲜的异种骨植入后数小时即发生补体参与的免疫排斥反应，局部组织红肿、渗出，大量淋巴细胞浸润，骨细胞溶解。T细胞、NK细胞、炎症因子参与的急、慢性免疫排斥反应数天后发生，局部无毛细血管长入，无新骨形成，哈佛管闭塞，胶原断裂，排列紊乱。随着时间延长，植入骨周围纤维组织包绕，无骨、软骨生成，最后植入骨被吸收或形成死骨排出。
（三）降低异种骨免疫排斥反应的方法
1.减少或去除骨中抗原成分的方法
1）煮沸法
煮沸骨无任何诱导成骨能力，不易被宿主骨结合替代。
2）射线辐射法
常用15000～30000Gy剂量的γ射线消毒移植骨并破坏移植骨抗原，但此种剂量可彻底摧毁移植骨的诱导成骨能力。
3）冷冻法
一般认为冷冻可降低移植骨的抗原性，但实际上仍可引起免疫反应，常发生高比例的不愈合、疲劳骨折和移植骨吸收。
4）冷冻干燥法
有报道移植冻干牛骨取得一定效果，但这种移植骨仍表现出较强的抗原性。试验和临床研究均显示，冻干牛骨促进骨愈合的效果逊于其他异种骨材料（如Kiel骨，Oswestry骨）。
5）高温煅烧法
牛骨经1000℃以上的高温煅烧后（如Pyrost骨），除去了所有有机成分，虽无抗原性但同时无诱导活性，又因其结构脆弱且难以吸收替代，单独使用效果不佳，多复合其他骨诱导物质使用。
6）脱蛋白处理法
一般认为，经脱蛋白处理去除有机基质，能消除因供体与受体组织相容性差异而产生的不良后果。脱蛋白骨多种多样，以Kiel骨和Oswestry骨的使用较多。Kiel骨是部分脱蛋白骨，其制备方法为过氧化氢浸泡、脂溶剂脱脂、丙酮干燥，其成品仍具微弱的抗原性，无诱导成骨能力。与Oswestry骨相比，因Kiel骨含有部分骨胶原基质，故有较好的机械性能和促进骨生长能力。Kiel骨在国外有商品出售。Oswestry骨是由过氧化氢和乙二胺两次处理制备的完全脱蛋白牛松质骨，植入异种宿主骨骼后，有新骨侵入，但在骨外部位无骨诱导能力；浸润自体骨之后，可作为良好的支架起骨传导作用。Bio-Oss也是使用较多的脱蛋白牛松质骨，其理化性质与人骨相近，可吸收，但也只能起骨传导作用。
2.抑制宿主的免疫系统
在异种骨移植时，可通过抑制受体的免疫系统，降低受体对异种骨的免疫排斥反应。
（贺海怿；汤立新；张春霖；娄朝晖）
