1854年由于研究工作的需要，巴斯德全家迁到了里尔城。里尔是法国北部的一座边境小城，接近比利时。当时的巴斯德在化学研究方面已有了很大的名气，因此被聘为里尔科学院院长兼化学教授。
巴斯德一到里尔城，便投入到紧张的研究工作中去了。他首先研究的是酒精的发酵问题。今天人们都知道，发酵，就是有机化合物在微生物的作用下分解，产生酒精、二氧化碳等物质的变化过程。可在当时，不少化学家认为，发酵是一种单纯的化学变化，其中虽然有活的酵母菌存在，但一经发酵，酵母菌就死了，最终是因为酵母分子振动，引起了甜菜的分解，才制成了酒精。巴斯德不同意这种看法，他认为发酵是酵母菌活着的时候作用的结果。要证明自己的观点，就必须用科学实验来说话，因为只有严格的实验结果才能使那些大化学家、教授们心服口服。
要用事实把他们驳倒，不是一件容易的事。化学实验，比较容易得结果，因为把不同的物质混合在一起，很快就能看到颜色的变化，溶液之间清晰度有什么不同，最多也就是等几个小时就知道。而要证明发酵过程中有活酵母菌在活动，验证它与化学的说法不同，在当时来说，就不那么容易了。因为它的变化需要时间，做实验的人需要耐心的等候，酵母菌的活动过程有时要等好几天才能出结果。这对做惯了化学实验的巴斯德来说，可真称得上是一次不小的考验。
19世纪的里尔，还是一个不起眼的边境小城，多年来，居民们一直保留着一个古老的传统，那就是天一黑人们就上床就寝。晚间街上，很少能看到灯光。可巴斯德一家的到来，仿佛使这古老的传统改变了。深夜，巴斯德的家中，常常射出明亮的灯光，有时甚至彻夜不息。灯光引来了不少好奇的人们，人们不时从巴斯德家窗前走过。“巴斯德先生在做什么？”大家猜测着，“难道他神经出了毛病？否则为什么天天晚上不睡觉？真是个让人猜不透的怪人。”
其实，此时的巴斯德正在做他的酒精发酵实验。他的实验室狭小而闷热，简直让人透不过气来。屋内堆满了做实验用的瓶子、玻璃管、蒸馏器、煤气灯等用具，墙角处还摆放着一台样子很奇特的烘炉，这是巴斯德亲手设计制作的。
实验室充满了一股呛人的化学药品气味。巴斯德满脸污黑，一双熬红的眼睛仍透着智慧的光芒。只见他不时从烘炉内取出瓶子仔细察看，然后又将瓶子重新放回烘炉内。结果似乎并不令他满意，他焦虑不安地在房间里来回踱步。
突然，他眼神中闪现出一种异样的兴奋，他迅速拿起一根玻璃棒，在瓶子里搅了搅，又放在鼻子上闻了闻，好像发现了什么，可终于沮丧地把瓶子扔进了墙角的污物桶，拳头狠命地在桌上捶了一下，然后自言自语地说：“我一定要找出一种证明它存在的方法。”
巴斯德正在为他的酵母菌发酵实验犯愁呢。巴斯德是个急性子，他一遍遍地做着实验，焦急不安地等着结果，可实验结果总让人不满意。究竟是什么地方出了问题呢？他反复思考着实验中的每一个细节。这次他重新改进了实验方法，把含有酵母菌的液体加以过滤，去掉杂质，然后在过滤液里加上糖和石灰。温度过低会使酵母菌死去，于是他就把酵母菌放入烘炉里保温。
巴斯德的实验又重新开始了，他按着新的实验步骤，耐着性子，不停地做，一次次地重复，前后做了上百次。终于，有一天，其中有一个管子发浑了，渐渐变成了灰色，巴斯德赶忙把瓶子放在鼻子前，一股酒精的气味散发了出来。他兴奋极了，这说明，酵母菌还活着，酒精气味的存在就是酵母菌活动的证明。巴斯德的酵母菌发酵实验获得了初步成功。
接下去的是，怎样才能把酵母菌的发酵实验引向深入呢？巴斯德想到了显微镜。
显微镜的出现对人类医学的进步有着特别重要的作用。说起显微镜的发明，那还是16世纪的事情。1590年有位荷兰眼镜商人的儿子，在玩弄镜片时偶然发现，用两块凸镜在一定距离内观察物体时，会使物象放得格外大，这引起了他父亲的格外注意，于是父子俩便将透镜固定在直径不同的圆筒上，并使小圆筒能在大圆筒内自由滑动，这就是世界上最早的显微镜。以后，德国人埃伯、意大利人马尔比基、英国人胡克也都做成了显微镜。不过，最终使显微镜得到重大改进并获得实际应用的是荷兰人列文虎克。他在1675年制成了自己的第一架显微镜，以后又不断改进，并用显微镜证实了马尔比基有关毛细血管的发现和精子对胚胎发育的重要性。
从显微镜的发明到此时，差不多已有200年了，可人们对它的用途真正了解得还不太多，科学家们也很少用到它。巴斯德是一位思维敏捷、想象力丰富、很善于接受新事物的人。这一点和其他化学家不同，他对显微镜有一种特殊的偏爱，喜欢把许多小东西放在显微镜下观察。他想，既然瓶子中有酒精气味，就说明酵母菌在活动，那么，为什么不把酵母液放在显微镜下看看呢？他取出一滴酵母液放到了显微镜下仔细观察。天哪！在显微镜下面竟有无数小的长圆形的东西在活动，这是真正的活着的酵母菌。巴斯德的心在突突直跳，他感到兴奋不已，浑身都在哆嗦。他的研究工作有了突破性的进展，他终于向世人证实了，发酵并非仅仅是一种化学变化，而是酵母菌活着的时候作用的结果。以后巴斯德又在此领域进行了更深入的研究，获得了更多的成果。
